‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析‘红肉脐橙’（Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara）八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并进行原核表达。【方法】以‘红肉脐橙’果实中分离的mRNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA片段,并分析其序列;利用PCR技术获得‘红肉脐橙’PSY cDNA的编码区全长,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+),获得重组质粒pET-CitPSY转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】‘红肉脐橙’PSY cDNA长1 520 bp,最大开放读码框为1 308 bp,可编码436个氨基酸,核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在75%和70%以上,并且发现‘红肉脐橙’PSY的N末端存在转运肽信号序列,成熟的PSY包含1个跨膜结构域。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为52 kD。【结论】该研究为进一步开展柑橘果实色泽分子改良奠定了基础。     

欧李八氢番茄红素合成酶cDNA克隆、序列分析及在大肠杆菌中的功能表达

 【目的】克隆、分析欧李[Cerasus humilis（Bge）Sok]八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并利用大肠杆菌异源表达体系验证其功能。【方法】以欧李果实中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA中间片段,再利用RACE技术获得该基因cDNA全长并分析其序列;然后利用PCR技术获得欧李PSY cDNA编码区全长,将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),获得重组质粒pET-ChPSY,转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达,并利用工程菌株验证融合蛋白6×His-PSY的催化活性。【结果】欧李PSY cDNA全长1 559 bp,最大开放读码框为1 194 bp,可编码398个氨基酸,命名为ChPSY。核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在70%和65%以上,并且发现欧李PSY的N末端存在1—55个氨基酸残基组成的转运肽信号序列,在37—58和219—240氨基酸区域包含2个跨膜结构域。SDS-PAGE分析表明,原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,相对分子量约为45.8 kD。通过大肠杆菌异源表达证实ChPSY可编码一个功能蛋白,促进工程菌株中β-胡萝卜素含量增加。【结论】该研究成功地克隆了欧李PSY cDNA全长并在大肠杆菌中功能表达,为进一步研究该酶蛋白特性和欧李果实类胡萝卜素的合成机制奠定了基础。     

薤白EPSP合成酶基因cDNA的克隆与原核表达分析

 【目的】揭示棉田杂草薤白（Allium macrostemon Bunge）抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶（EPSPs）基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。     

枣树ZjAPX基因的原核表达

为了解枣树抗氧化系统中抗坏血酸过氧化物酶基因的作用和功能,将从枣树结果枝cDNA文库中筛选获得的ZjAPX cDNA序列,连接到原核表达载体pGEX-4T-2,导入E.coli体内进行了表达产物鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明,1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h表达了蛋白产物;IPTG的浓度和诱导时间优化表明,1.2 mmol/LIPTG诱导5 h时,蛋白的表达量最大。研究为枣抗坏血酸过氧化物酶基因生物学功能的深入研究奠定了基础。     

甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建

根据C,enBank中登记的甜瓜八氢番茄红素合成酶（CmPSY）基因序列设计引物,利用lit—PCR技术克隆了甜瓜PSY全长基因,该基因全长1443bp,编码421个氨基酸,在GenBank中登记号为GU361622。以＆帆HI和剐I双酶切pMDI8-T—CmPSY和表达载体pBI121,再将回收的目的片段与pBI121用T4 DNA连接酶连接,结果证明,渊y正向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmPSY的重组质粒。该研究为了解甜瓜八氢番茄红素合成酶的活性调节机制,并通过基因工程手段研究甜瓜PSY的活性奠定了基础。     

金花茶CnCHS基因原核表达载体的构建及表达分析

根据已经克隆得到的金花茶（Camellia nitidissima Chi．）查尔酮合成酶基因序列,设计引物对P1／P2扩增出该基因全长并将其构建到原核表达载体 pGEX 4T 1中,转入大肠杆菌BL21后,用浓度为0．4 mmol／L的IPTG诱导其表达。SDS PAGE电泳检测结果显示,被诱导的大肠杆菌菌体中出现了约68 ku的特异融合蛋白,表明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

君子兰八氢番茄红素合成酶基因的克隆与序列分析

根据GenBank上登陆的黄水仙八氢番茄红素合成酶基因(登录号:X78814.1)设计特异引物,通过PCR扩增从君子兰cDNA中克隆出一个1.4 kb的片段。序列分析表明,这个序列全长1 395 bp,包含一个1 272 bp的开放阅读框,并且编码423个氨基酸。与水仙(DQ984674)、文心兰(FJ859988)和茶花(EF545005)相比,此cDNA序列显示出98%~76%的同源性,并且与水仙、猕猴桃、番茄和柿相比,其氨基酸序列显示出达到了99%~80%的同源性。由此可知,研究所克隆的序列为君子兰的PSY全长基因,该PSY基因已登陆GenBank(登录号:JF499694)。     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

人参鲨烯环氧酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶（SQE）基因,并进行原核表达与纯化,初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。【方法】以4年生人参根组织须根为材料,提取其总RNA,反转录为cDNA。以合成的cDNA为模板,对SQE基因进行克隆,再将其插入原核表达载体pET-30a中,构建pET-30a-SQE重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转入Rosetta大肠杆菌,经0.8 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达4 h后,进行SDS-PAGE电泳检测,采用NiAgarose亲和层析柱纯化目的蛋白,利用液相色谱串联质谱联用技术（LC-MS）检测SQE的活性。【结果】获得了人参SQE基因1 611 bp的全长编码区cDNA。酶切和测序结果表明,原核表达载体pET-30a-SQE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在Rosetta大肠杆菌中成功诱导表达了SQE融合蛋白,且纯化后的目的蛋白纯度较高;LC-MS联用检测结果发现,随着SQE用量的增加,达玛烯二醇的生成量递增。【结论】克隆了人参SQE基因,获得了在体外具有生物学活性的SQE蛋白,并证实了其活性与人参皂苷生成量有很大的相关性。     

大豆GmGolS基因的原核表达及抗旱性分析

肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase,简称GolS)是棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides,简称RFOs)生物合成途径中的关键酶,在植物应对非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。通过逆转录(RT)-PCR从大豆叶片cDNA中扩增得到编码肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS,再将GmGolS基因构建到原核表达载体pET28上,然后将载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,对其进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside,简称IPTG)诱导。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)结果表明,在诱导时间为3 h、IPTG浓度为0.1 mmol/L的条件下,可以获得大量重组蛋白,分子量约为40 ku。对表达GmGolS蛋白的大肠杆菌进行抗旱性分析的结果显示,GmGolS基因在大肠杆菌中的过表达降低了重组菌的生活力,使其对干旱胁迫更加敏...     

欧李茎尖组织培养研究

以欧李3号、4号品种为试材,初步建立了茎尖组织培养的快繁体系。结果表明:欧李对激素反应比较敏感。分化基本培养基采用MS优于B5和W h ite。在MS 0.25mg.L-1BA 0.1mg.L-1IAA的分化培养基上,萌发速度快,成苗率高。增殖培养时,增殖系数随BA浓度增大而提高;欧李3号在MS 0.5mg.L-1BA 0.075mg.L-1NAA的培养基上,增殖系数为5.43;欧李4号在MS 0.4mg.L-1BA 0.05mg.L-1NAA的培养基上,增殖系数为4.56,增殖效果较好。壮苗培养时,欧李3号适宜的培养基为改良MS 0.075mg.L-1NAA,欧李4号适宜的培养基为改良MS 0.05mg.L-1NAA。生根培养时,欧李3号适宜的培养基为1/2MS 0.4mg.L-1NAA;生根率达72.3%,欧李4号适宜的培养基为1/2MS 0.2mg.L-1NAA;生根率达74.6%。移栽采用草炭、田园土、珍珠岩(5∶2∶1),成活率达72.7%。     

4个钙果品种北种南引的适应性鉴选

为充实贵州水果市场,调整农村种植业结构和促进生态经济发展,对从山西、河南分别引进的钙果3号、4号、5号和6号进行了品种比较试验。结果表明:各品种在贵州成熟期比原产地提早60～75d,其中钙果5号树势最强,产量表现最好;其次为钙果3号;钙果4号和钙果6号表现较差。钙果3号和5号可以推广种植,4号和6号可按一定的比例作为授粉树配植。     

欧李的组织培养

对欧李不同外植体对分化率的影响及不同生很方法的生根效果进行了研究。结果表明，田间自然长出的带叶茎尖净增殖系数显著高于温室促萌茎尖的净增殖系数．其比值为4：1．2，生根生长素（IBA＋NAA）的最适总浓度为1～1．2mg／L，生长素短时间处理生报效果最佳，移栽湿度保持相对饱和，移栽成活率85％。     

不同处理对钙果扦插生根率的影响

通过对钙果不同枝条、基质、生根粉处理研究,结果表明钙果枝条的生根能力弱且普通的生根粉对其生根能力影响较小;扦插应选取基生半木质化枝条,宜选取通透性较好的基质;ABT1号处理的枝条在50~100 mg·L^-1浓度之间的生根率表现相近;ABT1号在蘸条30min后期生根率有明显的上升,2h后其生根率维持不再有明显上升。     

欧李对碳酸盐胁迫的光合响应

[目的]研究欧李对碳酸盐胁迫的光合响应。[方法]以浓度为100、200、300mmol／L的NaHCO3溶液浇灌3年生欧李苗,在盆栽条件下,于第7、11、15、21、30、36天测定苗木光合作角各项指标。[结果]随胁迫时间的延长,处理植株的气孔导度（岱）、蒸腾速率（开）、净光合速率（n）均呈现先升高后降低的趋势,前期高于对照,后期低于对照。胞间CO2浓度（a）前期升高,中期下降,后期变化不大。叶绿素a含量在前期变化不大,中期呈上升趋势,后期有所下降;叶绿素a／叶绿素b在整个处理时期变化平稳。[结论]整个处理期间,欧李显示出较强的耐盐性。     

欧李茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生

对欧李(Cerasus humilis)茎尖进行了玻璃化法超低温保存及植株再生研究,结果表明,预培养对欧李茎尖超低温保存有一定的影响,茎尖在含有0.5 mg.L-1BA和2 M甘油的B 5培养基上室温(25℃)下预培养3 d成活率最高;最佳预处理时间为60%PVS2处理10~20 min,玻璃化液(PVS2)处理时间为0℃下60 min.在优化的保存条件下,植株再生率达83.9%,再生植株生长和分化正常.这是欧李超低温保存成功的首例报道.     

钙果采摘装置技术参数的试验研究

为实现钙果的机械化采摘,根据钙果果实的生长特性及种植方式,设计了一种钙果采摘机。该机构利用旋转的钢丝碰撞果实进行脱果,通过调整双摘果辊轴心距,可适应不同形状和尺寸钙果的采摘。为确定机构的最佳工作参数,在分析机构特点和工作原理的基础上,对研制的样机进行了三因素混合的正交试验研究。根据因素的不同搭配对摘不净率的综合影响效果,得到各指标的最佳参数:摘果辊直径140mm,转速300r·min-1,进给速度80mm·s-1。研究结果可为钙果采摘装置的后续优化设计与改进提供重要的依据和技术基础。