猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及ORF5基因的序列分析

采集菏泽地区某猪场PRRS疑似病料,在Marc-145细胞上进行病毒分离,得到一株病毒HZ0622,通过免疫荧光试验初步鉴定分离病毒为PRRSV。对ORF5基因进行克隆和测序,并利用DNAStar软件将测定序列与国内外代表性毒株进行同源性比较,结果表明：分离株HZ0622 ORF5基因与美洲型代表毒株VR-2332的同源性为89.55%,与LV株同源性为61.17%,与中国高致病性PRRSV毒株JXA1、HEB1、SY0608、SD-4的同源性分别为98.84%、98.34%、99.00%、99.34%;进化树分析结果表明,分离株HZ0622和高致病性PRRSV在同一进化分支,且与2007年分离的SD-4有更近的亲缘关系。HZ0622分离株属于美洲型毒株,可能属于高致病性PRRSV。     

2010年-2011年广东地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了解2010年-2011年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法扩增所分离的16株PRRSV的Nsp2和ORF5的基因,应用DNA Star、ClustalX2和MEGA5等对所得序列进行比对及遗传变异分析。16株PRRSV的Nsp2和ORF5基因的推导氨基酸序列同源性分别为75.3%～100%和87.5%～100%,与国内高致病性PRRSV代表毒株JXA1的氨基酸同源性分别为74.2%～98.2%和87.5%～99%。Nsp2遗传进化分析显示,这16株PRRSV均属于美洲型毒株,其中15株病毒与以JXA1为代表的国内流行毒株处于同一分支,属美洲亚群Ⅰ;另外1株病毒与VR-2332和疫苗株MLV处在同一分支,属美洲亚群Ⅱ。2010年-2011年广东地区流行毒株仍为高致病性PRRSV,且存在经典疫苗毒株MLV。     

猪繁殖与呼吸综合征 病毒类NADC30毒株的新近流行

猪繁殖与呼吸综合征是严重危害养猪生产的病毒性传染病.自20世纪90年代中期在我国发生和流行以来,已经20余载.据田间流行优势毒株的不同,可大致分为三个阶段:经典毒株流行阶段(1995—2006年)、 高致病性变异株流行阶段(2006—2013年)和新近的类NADC30毒株流行阶段(2013年至今).2013—2014年间与美国分离株NADC30亲缘性较高的一类PRRSV毒株开始在我国暴发流行,其具有与NADC30和MN184等谱系1(lineage 1)毒株相同的nsp2编码区缺失模式.致病性分析及疫苗保护试验结果表明,其致病性介于高致病性毒株与经典株之间,目前商用疫苗对其保护效果不佳.且类NADC30毒株易与其他PRRSV毒株发生重组,产生新的变异株.类NADC30毒株的广泛流行,以及相关重组毒株的叠现,进一步增加了PRRS疫病防控的难度.     

我国苏皖地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了分析2009年安徽省和江苏省周边地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异特征,采用RT—PCR方法对该地区分离的22株PRRSV的Nsp2和ORF5基因进行了扩增、克隆和测序,并进行序列分析。结果表明：22株PRRSV均属于美洲型毒株,其中21个毒株的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征;而且此21个毒株的ORF5基因推导的氨基酸序列也发生多处突变,集中出现在毒力相关位点、抗原表位和糖基化位点序列中。只有HZNJ株与疫苗株的同源性较高。进化树分析显示,21个分离株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,而HZNJ株与疫苗毒株有较近的亲缘关系,进一步说明高致病性PRRSV已成为该地区的优势流行毒株。     

豫南地区部分猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒检测及ORF5遗传变异分析

为了解豫南地区猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行情况和流行毒株基因的遗传变异规律,本研究对2013年~2014年豫南地区部分发病猪场进行PRRSV检测,同时对分离株ORF5基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,并将其进行序列比对和遗传进化分析。结果表明:本研究检测的275份病料中,检测阳性样本为86份,阳性率为31.3%;测序的13株流行毒株,遗传关系上均属于美洲株;与VR2332毒株序列比对,13株分离株糖基化位点和抗原表位都有不同程度的变异;另外,遗传进化树分析表明,13株分离株中12株与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同属一个亚群,1株与HB-1(sh)/2002毒株同源性较高,表明目前豫南地区以高致病性PRRSV毒株流行为主,同时还有少部分过渡性毒株存在。研究结果为豫南地区PRRS的防治及新型疫苗的研制提供了依据。     

PRRSV安徽分离株NSP2和ORF7基因的克隆与序列分析

2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代～5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的NSP2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。结果表明,这两个分离毒株核苷酸同源性高于99.0%;在NSP2基因上,这两个分离毒株均发生30个氨基酸的不连续缺失,它们与CH-1a株之间核苷酸同源性分别为80.7%和80.2%;在ORF7基因上,与2007年国内高致病性猪蓝耳病毒株HuN4核苷酸同源性较高,分别为98.4%和99.5%,且ORF7基因均存在K46→R46,H109→Q109,V117→A117氨基酸突变。这些信息显示这两个安徽分离株属美洲型毒株,具有高致病性特征,与国内高致病性毒株位于同一基因群。     

浅谈如何做好禽流感的检测工作

已知的流感病毒分A、B、C3个血清型.A型的为人畜(禽)共患,B、C型仅对人致病.禽流感则是由A型禽流感病毒引起的传染病,又称真性鸡瘟(欧洲鸡瘟).按流感病毒的致病性不同分为3类:高致病性毒株如H5N1、中弱毒株如H9N2和无毒株.虽然禽流感病毒血清型很多,分离毒株上千株,但有致病性的毒株占极少数,大多数为无毒株,只有高致病性禽流感病毒才对养禽业造成毁灭性的损失.     

鸡传染性支气管炎病毒LN株基因组序列测定与致病性分析

为分析传染性支气管炎病毒(IBV)在我国的流行及变异情况,对2014年在辽宁省某发病鸡场分离得到的IBV毒株LN进行了基因组测序和致病性研究。结果显示,LN株基因组全长27 672 nt。遗传演化分析结果显示,LN株与国内代表流行株QX型IBV具有较近的遗传进化关系,与H120等常用疫苗株及其他经典毒株进化关系相对较远;LN株对3周龄SPF鸡有较强的致病性。提示:目前与H120等疫苗株差异较大的IBV毒株仍在我国流行,养殖生产中需要重视对这一类型毒株的防控。     

禽I型副粘病毒广西分离株F基因序列及毒力的研究

对源于鸡、鹅、鸽的 9株APMV_1广西分离株及我国常用的中发型疫苗毒株I系 (Mukteswar株 )的F基因N_端前段进行了RT_PCR扩增 ,产物进行核苷酸序列测定 ,用基因分析软件DNAStar进行分析并与已发表的其它参考毒株进行比较。结果发现 ,广西分离株在裂解位点的氨基酸组成和排列均符合强毒株的特征 ;根据F基因绘制的系谱树来看 ,广西鸡和鹅分离株都归属于基因型VII,证实近年来广西流行的基因型与国内其他地区的相同 ;并发现中发型疫苗毒株I系 (Mukteswar株 )也属于基因型VII。研究还对分离株进行了常规的毒力和致病性测定试验 ,并与根据F基因序列特征判定的结果相比较 ,结果发现其中一株鸽源和两株鹅源分离株根据常规方法判定的结果与毒株在临床上的致病性不相符 ,而根据F基因序列特征判定的结果与毒株在临床上的致病性相一致     

3株猪Ⅱ型圆环病毒的分离及基因组序列分析

为了解混合感染中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2009年与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的病料中分离的3株PCV2通过PCR、免疫荧光等进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar对序列进行拼接和分析。结果表明:分离得到的HUN-09株(GQ449670)、HUB-09株(GQ449671)和SD-09株(GQ449669)3个PCV2毒株其全基因组长度均为1768bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为95%～99.7%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为97.6%～98.5%,与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69%～70%。进化分析表明,本研究2009年分离的3株PCV2属于基因型PCV-2a。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒7个分离株全基因序列测定及遗传进化分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,本研究利用RT-PCR方法对2006年～2009年在我国部分地区分离鉴定的7株PRRSV分别进行9段基因片段扩增,测序分析表明,获得的病毒全基因序列与PRRSV JXA1变异株高度同源。并与GenBank中登录的其他70株PRRSV全基因序列进行遗传分析,根据构建的遗传进化树分析表明,中国大陆PRRSV分离株包含美洲型和欧洲型,美洲型可分为3个亚群,亚群1主要为以JXA1株为代表的病毒株,本研究中的7个分离株均为亚群1,其GP5主要中和抗原表位高度变异;亚群2主要为以CH-1a株为代表的病毒株;亚群3主要为以VR-2332株为代表的病毒株。欧洲型病毒株BJEU06-1、NMEU09-1分属于不同亚型。本实验为深入研究该病毒的遗传与变异及其分子流行病学研究奠定基础。     

2018年广东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因变异分析

为了解广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株ORF5基因遗传变异情况,采用RT-PCR对2018年采自广东部分地区疑似患有PRRS的猪肺组织样品进行PRRSV ORF5基因扩增以及克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明,成功扩增出18株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段。ORF5基因序列分析表明,18株PRRSV流行毒株ORF5基因核苷酸同源性为83.7%~99.8%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性为62.1%~99.8%。基于ORF5基因的遗传进化树分析表明,18株PRRSV流行株均为美洲型毒株。其中,10株与以JXA1为代表的高致病性毒株亲缘较近,2株与新型高致病性毒株FZ16A相似;1株与以NT1为代表的疫苗返强毒株亲缘较近,1株与以R98为代表的疫苗毒株亲缘性较近,4株与广东新报道的GM2和QYYZ毒株亲缘性较近。DNA推导氨基酸序列分析表明,18株流行株的氨基酸序列与国内已报道的代表株相比发生不同程度的变异,GP5抗原表位上存在着差异。研究结果揭示了广东地区PRRSV有新型强毒株、重组毒株以及疫苗返强毒株的流行,提示养殖者谨慎、合理使用疫苗,防止疫苗毒株返强和毒株重组,为该地区防控PRRS提供参考。     

猪流感病毒H1N1广东分离株HA基因的克隆与进化分析

采用常规的血清学试验和特异性RT-PCR,从广东不同地区猪场分离鉴定出8株H1N1亚型猪流感病毒(SIV)。用流感病毒血凝素(HA)基因通用引物扩增了8株病毒的血凝素(HA)基因,经克隆测序,HA基因全长1 757 bp,编码566个氨基酸。8个毒株的HA基因推导氨基酸序列分析表明,均含有8个潜在的N糖基化位点,且糖基化位点相同,其HA1、HA2之间切割位点序列为IPSIQSR↓G,从分子水平推论,此8株H1N1 SIV均属于非高致病性毒株。同源性分析表明,此8株病毒的氨基酸序列与经典SIV之间的同源性在92.3%~94.7%之间;与2009年甲型H1N1流感病毒同源性在80.4%~92.4%之间;与欧洲类禽SIV分离株同源性在80.4%~84.1%之间。进化关系表明,该8株SIV与A-swine-Shanghai-3-2005-H1N1同处一分支,与2009年甲型H1N1流感病毒和经典SIV分离株亲缘关系较近,与欧洲类禽SIV分离株亲缘关系较远。     

一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株的基因组特征

为了监测我国近年来流行的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR分段扩增,对2009年从山东发病猪场分离到的1株PRRSV SD0901的全基因组进行了序列测定和分析.结果表明,不包括Poly(A)尾,该毒株的基因组全长为15 320 nt;与高致病性PRRSV毒株间的全基因组核苷酸相似性为98.6％～98.7％;该毒株基因组的Nsp2编码区除存在与高致病性毒株相同的30个氨基酸的不连续缺失外,还存在468位的氨基酸缺失和在585-586位间插入1个氨基酸,同时,该毒株的结构蛋白GP2、GP3、GP4和M编码区分别存在1个氨基酸的突变.演化分析表明,该毒株尽管与高致病性毒株属于同一亚群,但形成一个独立的小分支.由此表明,该毒株为高致病性PRRSV的变异毒株,说明我国的高致病性PRRSV在流行过程中已出现变异.笔者的研究结果为监测和分析我国的高致病性PRRSV的变异与演化提供了有价值的基因组信息数据.     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒湘潭分离株GP5基因的遗传进化分析

湖南湘潭某猪场母猪出现流产、死胎等症状,疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致,将2头病猪肺脏样本送至实验室进行分子生物学诊断与分析。结果显示:样品均检测为PRRSV阳性,GP5序列同源性分析结果显示:PRRSV湘潭分离株与HP-PRRSV分离株(JXA1、CH-1a和TJ等)核苷酸同源性为94.2%～99.3%;与其它型PRRSV毒株同源性相对较低。遗传进化分析结果显示,研究获得的2株PRRSV毒株与国内流行的高致病性毒株(HP-PRRSV)所属分支相隔较近,提示研究获得的2株PRRSV分离株为高致病性毒株,且其GP5抗原表位存在变异。     

新疆阿克苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株致病性分析

本文选择新疆阿克苏地区猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）发病猪为研究对象,对分离株进行病毒分离、基因序列分析等工作,对8个PRRSV毒株NSP2基因序列的测定和比较,找出病毒的变异区。研究结果显示：XJNJ-1-1、XJNJ-1-3、XJNJ-6-2和XJNJ-6-3毒株为PRRS高致病性毒株,XJNJ-7-1、XJNJ-7-2、XJNJ-10-2和XJNJ-15-3毒株为低致病性毒株。说明新疆阿克苏既存在PRRS高致病性毒株,也存在PRRS低致病性毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1001株和GX1002株全基因组分子特征分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况及分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增2010年PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株基因片段,经克隆、测序、拼接,获得2个分离株的全基因序列。结果显示,不包括Poly(A)尾,GX1001株、GX1002株基因组全长分别为15329和15318 bp。同源性分析结果表明,2个分离株间全基因组核苷酸序列同源性为99.3%,与国内外北美洲型代表毒株间的全基因组核苷酸序列同源性为84.9%~99.5%,与欧洲型代表毒株间的同源性为61.5%~61.9%。序列分析结果表明,2个分离株的NSP2编码区均存在第481和533-561位,共30个氨基酸的不连续缺失,具有PRRSV高致病性变异毒株(HP-PRRSV)的遗传特征,但分别在不同区域出现新的突变、缺失及插入等变异现象。遗传进化分析结果表明,所有美洲型毒株可分为4个亚群,GX1001株和GX1002株均属于以高致病性JXA1株为代表的第4亚群。上述结果表明,本研究获得的PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株均属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异现象。     

两株高致病性PRRSV湖北分离株ORF5与Nsp2基因序列分析

2013年从湖北两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,接种Marc-145细胞,可致明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HBHS株和HBXN株)。采用RTPCR方法,对ORF5基因序列和Nsp2基因部分序列进行扩增并测序,并用DNA MAN软件将测序结果与国内外发表的13株参考毒株进行比对分析。结果显示,2株分离株Nsp2基因与国内高致病性JXA1、GD2007、GD2008毒株的氨基酸同源性很高,介于98.5%~99.5%;且该基因与国内其他变异株有完全一致的缺失特征;ORF5基因与国内高致病性毒株的氨基酸同源性为98.1%~99.5%,且系统进化树遗传距离很近,同处一个基因群中,而与CH-1a等经典毒株较远。这两株分离株均属于PRRSV美洲型变异株,此结论为该病的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

猫杯状病毒分离株VP1基因序列与致病性分析

旨在了解上海地区猫杯状病毒(feline calicivirus, FCV)VP1基因与致病性,采用常规方法分离鉴定出13株FCV,经RT-PCR和测序获得分离株VP1的基因序列,与参考株VP1基因进行同源性和遗传演化分析,对2株分离株进行动物致病性试验。结果显示,13株上海地区分离株VP1基因核苷酸序列相互间相似性为74.3%～99.8%,与参考株核苷酸序列和氨基酸序列相似性也较低,符合FCV易突变的特征;进化树分析表明,上海地区FCV流行株主要来自国内北方地区,少数毒株来自国外地区;通过对宿主临床症状、VP1进化树和VS-FCV特征性氨基酸位点进行分析,筛选出7株FCV强毒株;动物致病性试结果验表明,FCV-SH202101株和FCV-SH202113株可导致感染猫发病和死亡,潜伏期为1～2 d,接种后第3天即可检测到排毒,不同年龄段猫的病程不一致,可导致幼猫5 d后死亡,成年猫病程可持续11～18 d, 2株分离株在致病性方面均符合VS-FCV特征。本研究丰富了中国FCV的分子流行病学资料,为VS-FCV毒株的筛选提供了有力的证据,也为FCV疫苗的研究提供了技术支持。