昆虫线粒体DNA A+T富集区的研究及其在分子进化中的应用

昆虫是与我们息息相关的一个庞大类群,昆虫的起源进化是动物系统学研究的一个重要领域,其研究主要根据历史记载、化石记录、形态学和细胞学观察以及通过应用免疫学、生态学、遗传学等领域的技术来进行.近年来,分子生物学、计算机技术以及几类遗传标记的发现和应用为生物进化和起源的研究提供了新的切入点,即从分子水平上直接研究昆虫进化.     

家蚕线粒体DNA分子系统学研究展望

线粒体DNA具有独特的结构特征和进化特点,是系统进化研究的一种良好的分子标记。本介绍了动物线粒体DNA的结构特征、进化特点及其在分子系统学业上的应用,并提出通过家蚕及其近缘种的线粒体DNA进化分析,将为家蚕的起源、种系演化以及特定遗传结构的形成原因的研究提供重要证据。     

中国野桑蚕mtDNA中A+T丰富区片段的克隆及序列分析

对中国野桑蚕mtDNAA +T丰富区片段进行了克隆和序列分析。在所测定的 72 0bp左右的片段中 ,A +T含量为 92 0 8% ,与不同家蚕品种的mtDNA相近 ,中国野桑蚕与家蚕之间的核苷酸序列呈高度同源性 (98%以上 ) ;但与日本野桑蚕相比 ,中国野桑蚕mtDNA的A +T丰富区片段 ,缺少 2个 12 6bp的重复单位 ,A +T含量低 0 9% ,核苷酸序列同源性也较低 (72 % )。该片段与中系家蚕mtDNA比较 ,有 15个变异位点。对mtDNAA +T丰富区的中国野桑蚕和日本野桑蚕及中系、日系和韩国的 4个家蚕品种进行聚类分析表明 ,日本野桑蚕有可能由中国野桑蚕分化而来。     

家蚕、野桑蚕线粒体Cyt b基因片段序列分析及分子进化研究

以家蚕中系一化地理品种延吉、印度多化品种迈索尔、欧系一化品种法 4 0 8油和中国镇江地区野桑蚕为材料 ,采用PCR技术扩增了其线粒体 (mitochondrialDNA ,mtDNA)细胞色素b(cytochromeb ,Cytb)基因 ,测定其 5′端5 91bp的核苷酸序列 ,并从GenBank中调取中系家蚕品种C10 8、夏芳 ,日系家蚕品种青熟 ,韩国家蚕品种Backokjam和日本野桑蚕的相应序列 ,进行同源性比较 ,发现日系家蚕品种青熟 ,印度家蚕品种迈索尔 ,欧系家蚕品种法 4 0 8油 ,韩国家蚕品种Backokjam和中系家蚕品种C10 8、延吉序列间的同源性最高 ,相互间均为 10 0 % ;日本野桑蚕与各家蚕品种序列间的同源性约 94 %～ 95 % ;中国野桑蚕与各家蚕品种序列间同源性约 98%～ 99%。分子进化树分析显示日本野桑蚕和各家蚕品种相应序列的分歧时间远远早于中国野桑蚕与各家蚕品种序列的分歧时间 ,这是在分子水平上证实家蚕起源于中国野桑蚕的证据之一。     

家蚕线粒体基因组EcoRⅠ2.0kb片段的克隆及序列分析

对家蚕线粒体基因组EcoRⅠ 2 .0kb片段进行了克隆和序列分析 ,结果表明该片段包含完整的丝氨酸转移RNA基因、NADH氧化还原酶亚基Ⅰ基因、细胞色素氧化酶b亚基基因的部分序列。与果蝇 (Drosophilamelanogaster)的mtDNA进行了同源性比较 ,并根据无脊椎动物线粒体基因组密码子表 ,推定氨基酸序列。     

基于线粒体DNA D-loop区序列分析中国及新西兰奶山羊遗传进化关系

[目的]分析我国地方培育奶山羊品种与国外引进品种的遗传进化关系。[方法]以4个国内奶山羊品种（文登奶山羊、关中奶山羊、崂山奶山羊、雅安奶山羊）和3个新西兰引进奶山羊品种（阿尔卑斯奶山羊、吐根堡奶山羊、萨能奶山羊）为研究对象,采集33只个体的外周血样本,提取血液基因组DNA,利用PCR法扩增线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）D-loop区全长序列,对测序获得的序列进行生物信息学分析,探究不同奶山羊品种的遗传多样性及进化关系。[结果]7个品种奶山羊的mtDNA D-loop区中A、T碱基含量高于G、C碱基含量。共检测到82个多态位点,25个单一多态位点,55个简约信息位点。各品种单倍型多样度（Hd）范围为0.905~1.000,核苷酸多样度（Pi）范围为0.001 51~0.013 32;共存在26种单倍型,文登奶山羊和萨能奶山羊各有5个单倍型,阿尔卑斯奶山羊有4个单倍型,崂山奶山羊、吐根堡奶山羊、关中奶山羊、雅安奶山羊各有3个单倍型;各品种核苷酸平均差异数（K_XY）范围为6.400 00~38.450 00,核苷酸歧异度（D_XY）范围为0.005 79~0.034 76,遗传分化系数（G_ST）范围为0.000 00~0.186 05,遗传分化指数（F_ST）范围为0.231 56~0.971 52。品种间系统发育树表明,文登奶山羊和崂山奶山羊聚为一支;关中奶山羊与3种新西兰奶山羊遗传距离较近,从遗传学角度证实了关中奶山羊由国外奶山羊与地方品种经杂交选育而成;雅安奶山羊与其他品种遗传距离最远。[结论]中国奶山羊存在2个支系起源且未发现群体扩张;中国培育奶山羊品种含有较多的国外奶山羊血统;文登奶山羊与崂山奶山羊亲缘关系较近,雅安奶山羊在遗传进化中可能存在地域隔离。     

老挝家蚕线粒体cox3基因序列分析及分子进化研究初探

对老挝家蚕品种L11的线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)cox3基因(cox3)进行PCR扩增、克隆和序列分析。结果表明,在测定的909bp的片段中,含有ATPase 6基因及tRNA-Gly基因的部分序列和cox3全序列。其中,cox3读码框包括789个核苷酸,编码262个氨基酸。L11 cox3和已经公布的家蚕(中国家蚕品种夏芳、日本家蚕Aojuku、韩国家蚕Backojam)mtDNAcox3基因完全一致,但与日本野桑蚕、中国野桑蚕的氨基酸同源性分别为99%和98%。     

家蚕线粒体基因组1.8kb片段的克隆及序列分析

克隆并测定了家蚕 (Bombyxmori)线粒体基因组 1781bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切片段序列 ,根据序列同源性比较 ,推测该DNA片段包括 :ND1基因、16SrRNA基因 3′端、tRNALeu(UAG)基因和一个尚待确定的tRNA基因。家蚕与果蝇ND1基因序列同源性约为 81 85 % ,16SrRNA基因 3′端序列同源性约为 74 5 %。在家蚕、果蝇、蜜蜂、蝗虫、卤虫和人 6个物种中 ,线粒体ND1编码的疏水性氨基酸比例较稳定 ,显示了ND1基因的保守性。对上述 6个物种ND1基因序列和 16SrRNA基因 3′端序列进行系统进化分析 ,构建了系统进化树。     

家蚕线粒体基因组EcoRⅠ2.0kb片段的克降及序列分析

对家蚕线粒体基因组ＥｃｏＲⅠ２．０ｋｂ片段进行了克隆和序列分析，结果表明该片段包含完整的丝氨酸转移ＲＮＡ基因、ＮＡＤＨ氧化还原酶亚基Ⅰ基因、细胞色素氧化酶ｂ亚基基因的部分序列。与果蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）的ｍｔＤＮＡ进行了同源性比较，并根据无脊椎动物线粒体基因组密码子表，推定氨基酸序列。     

貂熊线粒体基因组全序列分析及其系统进化

为了更好地了解貂熊（Gulo gulo）的起源、进化等生物学信息,采用PCR方法克隆貂熊的线粒体基因组全序列,利用测序技术等常规分子生物学手段对其进行分析。结果显示：貂熊基因组序列全长为16 575 bp;同其他哺乳动物相同,含13种蛋白质、22种转运RNA(tRNA)、2种核糖体RNA(rRNA)和1个非编码控制区（D-loop）。4种碱基组成分别为：A=32.18%、G=14.26%、T=26.75%、C=26.81%;AT含量（58.93%）>CG含量（41.07%）,存在显著的AT富集。基于基因组全序列数据,以棕熊（Ursus arctos）为外群,采用邻接法和最大似然法构建鼬科（Mustelidae）22种动物的进化树,结果显示貂熊同貂属（Martes）动物关系较近,貂熊同7种貂属动物聚成一支后,再同猪獾（Arctonyx collaris）和狗獾（Meles meles）聚成一支组成并系群,结果证实貂熊同渔貂（Martes pennanti）和黄喉貂（M. flavigula）的亲缘关系最近。     

中国野桑蚕和家蚕的AFLP分析

利用AFLP技术和统计学分析原理 ,对我国具有代表性的 10个不同地区野桑蚕和 33个家蚕品种以及 5个作为外群对照的柞蚕品种进行了分子系统学研究。研究结果表明 ,不同地区野桑蚕之间的遗传距离 (0 0 0 0～0 419)与家蚕品种之间的遗传距离 (0 0 0 0～ 0 40 6 )相似 ,而家蚕与野桑蚕之间的遗传距离为 (0 35 5～ 0 5 32 ) ,明显地小于家蚕与柞蚕 (0 76 1～ 0 86 5 )和野桑蚕与柞蚕 (0 776～ 0 839)之间的遗传距离 ,进一步证明了家蚕起源于中国野桑蚕。聚类分析发现 ,中国一化种与二化种聚类在一起 ,中国二化种与热带种聚类在一起 ,热带种不与一化种聚在一个类群 ,这一结果证明中国二化种在进化上介于一化种和热带多化种之间     

家蚕滞育分子机制的研究

简述了有关家蚕滞育机制的分子生物学研究进展。家蚕的胚胎滞育是由环境条件和遗传性支配的。二化性蚕品种在胚胎中期和晚期经受高温和长光照 ,其结果是下一代胚胎滞育。不同的环境信息被神经分泌细胞“解读”和“受纳”。在特定的环境条件信息下 ,神经分泌细胞产生和分泌滞育激素 (DH)。滞育激素进入卵内 ,调节和建立滞育卵专一的内部环境。其特征是 ,滞育卵中发生有关糖原和山梨醇转换的一系列酶促反应 ,从而实现进入滞育、解除滞育等生理过程。     

家蚕普通气味结合蛋白基因的表达及分子进化研究

昆虫的普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)是气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)家族中的重要成员,与昆虫感受低特异性气味分子刺激相关,在觅食、求偶等生理行为过程中发挥重要的作用。基于家蚕5龄第3天幼虫的基因芯片和蛹期、成虫期的RT-PCR表达谱分析发现,家蚕的GOBP1蛋白基因(gobp1)主要在幼虫的头部及蛹和成虫的触角中表达,在幼虫的睾丸以及成虫的胸足、体壁、脂肪体等非感受器官中也有表达,而GOBP2蛋白基因(gobp2)的表达谱和gobp1相比明显较窄。该结果表明家蚕gobp1以感受气味分子刺激的功能为主,同时还可能具有其他尚未被发现的生理功能;而家蚕gobp2可能具有对气味感受更高、更专一的功能特点。对家蚕及其他12种鳞翅目昆虫的GOBP蛋白序列比对发现,各物种间的GOBP蛋白序列相似性很高,蛋白二级结构元件也高度相似,具有的昆虫OBP典型结构中的半胱氨酸(C)位点非常保守。基于非同义突变与同义突变比值(Ka/Ks)的分子进化分析显示,13种鳞翅目昆虫的GOBP蛋白基因仅有棉铃虫gobp1在分化中受到正向选择作用,揭示不同昆虫的GOBP蛋白基因可能具有相似的生理功能。     

家蚕基因组DNA甲基化分析

DNA甲基化在生物的基因表达调控与发育调节过程中具有重要作用。应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对7个家蚕保存品种的胞嘧啶甲基化模式和程度进行评估。在所能检测的CCGG序列中,至少有8.6%~10.9%的胞嘧啶发生了甲基化;12对引物共获得1 156条扩增带,其中376条在品种间呈多态性,多态性比例为32.5%。结果显示:家蚕基因组可检测到DNA甲基化,各品种间的甲基化模式存在差异,CCGG序列中胞嘧啶外部甲基化(10.9%)高于内部甲基化(8.6%)。     

家蚕尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶基因(BmUGT004965)的克隆和表达谱分析

糖基化作用在抑制和排除生物体一系列内生和外生有毒化合物的过程中非常重要,尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UGTs)参与了这一过程。在分析家蚕基因组中存在的UGT基因时选取其中的一个基因进行生物信息学分析与分子生物学实验,经分子克隆和表达谱分析,将该基因命名为BmUGT004965,其开放读码框(ORF)长1 578 bp,编码525个氨基酸,预测分子质量60.3 kD,等电点9.13。该基因编码蛋白的N端具有一段由19个氨基酸组成的信号肽序列,而且N端和C端各有一段疏水的跨膜区。将该基因cDNA与家蚕基因组序列进行比对表明其具有4个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。将家蚕BmUGT004965基因与人类、果蝇、昆虫杆状病毒、植物及已报道的家蚕UGT基因进行氨基酸水平的比对,显示氨基酸序列一致性为20%～30%;多重序列比对结果表明C端序列的保守性高于N端区域,可能与UGT具有2个主要的功能域有关。实时定量RT-PCR检测表明,在5龄第3天家蚕幼虫的9种组织中,BmUGT004965基因只在丝腺和脂肪体中有表达,且丝腺中的表达丰度明显高于脂肪体,这与基因芯片的结果一致,推测这种特异的表达方式可能与其特异的功能有关。     

野桑蚕、家蚕LSP基因5''''侧翼区的克隆与序列分析

根据已报道的家蚕朝日×东海的幼虫血清蛋白LSP基因序列设计1对引物,以野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的基因组DNA为模板,分别克隆了野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的LSP,基因5’侧翼区,约1.9kb,并进行了序列测定与分析。结果表明:克隆的野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的LSP基因5’侧翼区涵盖了第一内含子、第一外显子、启动子区及其5’上游区;野桑蚕LSP基因5’侧翼区与朝日×东海LSP,基因5’侧翼区的同源性达96.4％,其中第一内含子、第一外显子的同源性分别为91.6％,100％;家蚕苏·菊×明·虎的LSP基因5’侧翼区与朝日×东海LSP基因5’侧翼区的同源性达98.9％,其中第一内含子、第一外显子的同源性都为100％,核心启动子区具有典型的TATA盒,还有数种昆虫脂肪体内组织特异性表达基因的共有序列和推定的激素响应元件等功能元件;野桑蚕的LSP基因启动子的5’上游区(-304～598bp)与J139家蚕丝素轻链基因第一内含子区域(7639～7933bp)的同源性达90.6％,-913～-1383bp为失活的部分水手转座子元件。     

DNA分子标记检测家蚕黄海、苏春品种和纯度的研究

利用单粒卵微量DNA抽提法,从家蚕黄海、苏春及其一代杂交种转青蚕卵快速提取出基因组DNA。筛选出的RAPD随机引物S60稳定扩增出2个原种的DNA特异性片段RH-Ⅰ440和RS-Ⅱ1000,克隆和测序后发现分别为463bp和约938bp。利用网上数据库进行序列分析,RH-Ⅰ440的nt2-462与一个家蚕wholegenomeshotgunsequence(WGS)(No:BAAB01096026.1)的nt1644-2104有96%的一致性,其中存在2个Caps。RS-Ⅱ1000的nt3-935与另一个家蚕WGS(No:BAAB01031489.1)的nt1046-1989有97%的一致性,其中存在13个Gaps。RH-Ⅰ440和RS-Ⅱ1000可以作为两个品种RAPD特征DNA片段进行品种和纯度的鉴定。     

家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。