无选择标记转基因植物的研究进展

为了避免选择标记基因的使用对环境及植物体的生长发育带来的不利影响,消除人们对转基因植物中选择标记基因的安全性顾虑,培育无选择标记的转基因植物目前已成为植物基因工程研究的热点.现主要综述几种剔除选择标记基因方法在转基因植物中的研究进展.     

利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花

为获得具有无选择标记的转基因菊花,构建了一个双T-DNA超级双元载体pCAMBIA1301-gus,其中一个T-DNA结构域中含有选择标记基因hpt,另一个T-DNA结构域中含有目的基因gus,而且两个T-DNA结构顺序相连,中间没有其他插入序列.利用农杆菌介导转化菊花幼嫩茎尖薄层细胞,共获得506个抗性植株,通过PCR和Southern杂交检测表明共转化率为38.4%,对其中17个同时整合了hpt和gus基因的植株自交获得的T1代株系进行检测,发现约有15.8%的T1代植株中不含选择标记基因hpt,结果表明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记转基因植物.     

无抗性选择标记转基因技术在蔬菜作物上的应用

在广为应用的植物转基因技术中,绝大多数采用各种抗性基因作为选择标记,而这正是转基因植物对生态环境和食品、药品安全影响的隐患所在。目前主要通过无抗性选择标记转基因技术即安全选择标记的利用和标记基因删除法来克服这一问题。本文对正在应用的安全选择标记和标记基因删除法的最新研究进展及其在蔬菜作物上的应用情况进行综述,并简要分析了各方法的利弊和发展前景。     

利用双T-DNA载体系统获得无选择标记转基因菊花的研究

为获得具有无选择标记的转基因菊花,构建了一个双T-DNA超级双元载体pCAMBIA1301-gus,其中一个T-DNA结构域中含有选择标记基因hpt,另一个T-DNA结构域中含有目的基因gus,而且两个T-DNA结构顺序相连,中间没有其他插入序列。利用农杆菌介导转化菊花幼嫩茎尖薄层细胞,共获得506个抗性植株,通过PCR和Southern杂交检测表明共转化率为38.4%,对其中17个同时整合了hpt和gus基因的植株自交获得的T1代株系进行检测,发现约有15.8%的T1代植株中不含选择标记基因hpt,结果表明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记转基因植物。     

《中国蔬菜》2011·12 学术论文导读

无抗性选择标记转基因技术在蔬菜作物上的应用王烨等(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100081)—《中国蔬菜》2011(12)在广为应用的植物转基因技术中,绝大多数采用的是各种抗性基因作为选择标记,而这正是转基因植物对生态环境和人类食品、药品安全影响的隐患所     

木糖筛选系统在蔬菜遗传转化上的应用

随着蔬菜转基因技术的不断发展及转基因产品的商品化，公众对抗性标记基因及其产物安全性的质疑成为植物转基因面临的一个重要问题。构建基于生物安全标记基因的遗传转化体系是当前植物转基因的发展趋势之一。主要介绍了以木糖作为筛选剂的安全转化系统在蔬菜基因工程育种上的应用。     

园艺及园林观赏植物抗病基因类似物的研究进展

目前已从不同植物中分别克隆出70余个植物抗病基因.根据已克隆的抗病基因的结构特征,可分为4大类:NBS-LRR、STK、胞外LRR、STK与胞外LRR.对于园艺及园林观赏植物抗病基因同源序列(RGA)的研究已应用在基因克隆、分子标记、基因定位和基因进化中,但相关报道较少.RGA的分析,对于在果蔬生产及园林绿化上指导我们培育具有广谱性抗病的植物品种具有深远的意义.     

草坪草转基因发展技术对社会的潜在影响

草坪草的转基因技术有了很大的发展,目前已经在各种草坪草上转入了多种基因.在转基因育种技术对草坪草遗传改良具有很大优势的情况下,其潜在的风险也不容忽视,如超级杂草问题、对草食动物的安全性、对非靶生物的影响等.通过转基因植株实验室管理、花粉飘移控制、利用无选择标记的转基因技术以及禁止个别易杂草化草坪草某些基因的转化和应用等措施,能减少这种潜在的风险.     

安全选择标记的转基因食用菌研究进展

在食用菌外源基因转化过程中,目的基因的导入常需要串联易于识别的选择标记基因,用于转化子的筛选。当筛选完成后,选择标记基因特别是抗性标记基因的存在即是多余的,甚至是有害的,存在生物安全隐患。有鉴于此,本文对获得安全选择标记基因的转基因食用菌作一综述。     

西瓜抗病毒RNAi植物表达载体的构建

为了研究转化同一种病毒的不同基因在转基因西瓜中引发RNA沉默的效果以及利用RNA沉默培育抗多种病毒的策略,以pFGC5941为骨架质粒,分别构建了ZYMV cp、nib和Hc-Pro基因的反向重复植物表达载体pFIRZYMVCP、pFIRZYMVNIb和pFIRZYMVHc-Pro;利用重叠延伸PCR的方法,首先构建了含有CMV cp、WMV cp和ZYMV cp部分基因片段的CWZ cp三价基因,采用该三价基因构建了CWZ cp基因的反向重复植物表达载体pFIRCWZ CP。研究首次在国际上构建了西瓜转基因抗病毒RNAi植物表达载体,为探讨RNA沉默在转基因抗病毒西瓜中的应用奠定了基础。     

无选择标记的植物表达载体的构建

以双元载体pBINPLUS为基础,在T-DNA侧翼区通过两次特异PCR、酶切和连接相结合的方法,构建了一个无标记载体pBINMF (marker-free vector)。通过酶切后测序分析,这个无标记载体在T-DNA左、右边界之间只有一个多克隆位点 (multiple cloned sites, MCS)。为了验证该载体的遗传稳定性,将gus基因克隆到该载体上并通过农杆菌介导的方法转化番茄栽培品种Moneymaker,特异PCR扩增目的基因和GUS组织染色结果表明,gus基因已经整合进入番茄基因组并得以表达。该载体为今后直接获得无标记基因、生物安全的转化体,尤其为象马铃薯、木薯等无性繁殖材料的无标记基因转化提供了可靠、有效的工具。     

Cre/loxp系统的构建及无选择标记转基因苹果植株的获得

从‘霞晖8号’桃中克隆了一个定位于第4条染色体上的钾转运体基因PpeKUP5,该基因编码625个氨基酸,具有10个跨膜结构域;PpeKUP5主要在根部表达,其次是叶和茎中,花和果实中的表达量极低;ABA、重金属Cr和Zn处理均显著诱导其在桃幼苗各组织中的表达,其中Cr处理最为显著,高钾胁迫及重金属Cu处理显著降低了其在根部的表达水平;细菌互补试验表明PpeKUP5具有吸收外界K+（KCl或K2SO4）的功能,且在偏中性pH值条件下最为显著。本研究表明PpeKUP5是一个主导桃树根部K+吸收的钾转运体,并可能在桃树适应高钾及重金属Cr、Zn和Cu等胁迫处理和ABA 响应中起着重要作用。     

安全标记基因pmi在果树转基因研究中的应用进展

 关于木本植物转基因成功的报道很多,但木本果树的转化效率较低。甘露糖/PMI筛选体系以pmi为安全标记基因,实现对转化细胞安全、高效地正向选择。从甘露糖/PMI筛选体系的作用原理,影响其筛选效率的主要因素,与其它筛选体系的对比优势（高效、安全、易于检测）等几个方面综述了这一筛选体系在木本果树转基因研究上的应用现状及其发展前景。     

Evaluation of an alternative D-amino acid/DAAO selection system for transformation in apple (Malus × domestica Borkh.)

Summary

The conventional selection system for apple transformation is based on the selectable marker gene, nptII, encoding antibiotic resistance against kanamycin. We tested an alternative selection system based on the use of D-amino acids using the gene, D-amino acid oxidase 1 (dao1) as the selectable marker, in order to avoid the presence of antibiotic resistance genes in the resulting transgenic apple plants. In addition, dao1 allowed the selection as well as the elimination of dao1-transgenic plants, based on differences in the toxicity of different D-amino acids. Regeneration experiments using apple leaf explants revealed that 2 mM D-serine or D-alanine inhibited shoot regeneration. We performed transformation experiments using the apple cultivars ‘Gala’, ‘Holsteiner Cox’, and a progeny of the apple cultivar ‘Pinova’, and the vector p35S::dao1-intron, containing the dao1 and nptII selectable marker genes. Several shoots regenerated successfully on selection media containing various concentrations of D-serine or D-alanine, but transgenic shoots were not obtained. However, three dao1/nptII transgenic apple lines were obtained after selection with kanamycin, indicating that the vector was functional. Furthermore, we showed that 20 mM D-serine could be used to select dao1-transgenic shoots from non-transgenic in vitro shoots, whereas 13 mM D-isoleucine had the opposite effect.     

Current trends in the genetic engineering of vegetable crops

Vegetables play an important role in human nutrition and health. Cultivation of vegetable crops is an integral part of the agricultural economy of many developing countries. Vegetable crop productivity and quality are seriously affected by several biotic and abiotic stresses, which destabilize rural economies in many countries. Moreover, absence of proper post-harvest storage and processing facilities leads to qualitative and quantitative losses. In the past four decades, conventional breeding has contributed significantly for the improvement of vegetable yields, quality, post-harvest life, and resistance to biotic and abiotic stresses. However, there are many constraints in conventional breeding, which can only be overcome by advancements made in modern biology. In the last decade various traits such as biotic stress resistance, quality and storage life have been successfully engineered into vegetable crops and some of them have been commercialized. In recent years significant progress has been made to manipulate vegetable crops for abiotic stress tolerance, quality improvement and pharmaceutical and industrial applications. Although the progress in commercialization of transgenic vegetable crops has been relatively slow, transgenic vegetables engineered for nutraceutical and pharmaceutical use will contribute significantly to the value added agriculture in near future.     

紫红线茄转基因体系的优化及基因SmARF8基因RNA干涉表达载体的遗传转化

建立了以紫红线茄下胚轴为外植体的高效转基因体系。利用该方法,以获得茄子SmARF8基因RNA干涉转基因植株为目的,构建了以NPTⅡ基因为筛选标记的融合表达载体pCAMBIAI 35S-2300-SmARF8-INT,并通过农杆菌介导,侵染茄子下胚轴外植体。含有2 mg · L^-1吲哚乙酸,0.5 mg · L^-1玉米素,25 mg · L^-1卡那霉素和500 mg · L^-1头孢氨苄的MS选择培养基可直接诱导外植体产生转基因分化苗,再生率达到80%。转基因苗继续生长并在不含激素的MS培养基上产生健壮根系,最终获得转基因株系。RT-PCR和qRT-PCR分析验证了T₀代转基因株系中内源基因SmARF8被干涉后不表达或表达量降低,Southern blot分析显示选择的T₀代转基因株系中存在1个T-DNA插入拷贝。以上研究结果表明利用建立的转基因体系SmARF8基因在茄子中被成功敲除。     

葡萄糖氧化酶( GO ) 基因在番茄中的遗传转化

 将来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶( glucose oxidase, GO ) 基因与病原诱导启动子Prp1-1融合,构建了植物表达载体pCPGO, 该载体具有抗除草剂PPT选择标记。经农杆菌介导转入番茄自交系, 获得了阳性转基因植株58株, Southern杂交结果表明, GO基因已整合到番茄基因组中。通过淀粉- KI显色反应和定量检测, 表明GO基因已经表达。转基因植株花器及开花正常, 种子一旦萌发, 其生长、发育各时期均正常。但结实率有所减少, 种子萌发率有所降低。用番茄叶霉病( Fulvia fulva) 病原菌1.2.3.4生理小种侵染T₁ 代转基因植株, 结果显示转基因番茄植株的抗病性有不同程度的提高, 多数发病时间推迟, 病情明显减轻。经测定与抗病性相关的几个指标, 结果转基因番茄叶片中SOD、POD、CAT的活性和蛋白质含量均增高。     

果树转基因研究进展与产业化展望

综合有关文献归纳了15年来果树转基因研究成果,其中包括:(1)已实现转基因的果树种类,目前世界和我国的大宗水果苹果、柑橘、梨、桃、葡萄、香蕉、猕猴桃和草莓等均已成功实现遗传转化;(2)通过转基因改变的农艺学性状类型,如抗病虫、抗逆、提高果实贮藏性能、缩短童期和改善果实品质等;(3)对几个重要的遗传转化研究实例作了具体介绍。同时还阐述了转基因果树产业化现状和大田试验现状,探讨了转基因果树产业化进程滞后的原因和发展前景以及促进果树产业化发展可采取的一些策略。