薤白EPSP合成酶基因cDNA的克隆与原核表达分析

 【目的】揭示棉田杂草薤白（Allium macrostemon Bunge）抗草甘膦的分子机理,开发利用其草甘膦抗性特性。【方法】运用RT-PCR结合RACE技术,分离克隆了薤白中草甘膦作用的靶酶EPSP合成酶（EPSPs）基因cDNA,并将其构建成原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达和鉴定其抗性。【结果】薤白EPSP合成酶基因cDNA序列全长1 821 bp,编码一段522个氨基酸的推导蛋白质。经BLAST及蛋白质结构预测,蛋白具有EPSPs的特征序列,并与已报道的EPSPs序列有高同源性,确认克隆的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列,命名为EPSPsA。将该cDNA与原核表达载体pRSET-A重组后,构建成重组表达质粒pRSET-A-EPSPsA,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导了目标蛋白的高效表达。经SDS-PAGE电泳分析显示,该蛋白的分子量约为55 kD,与预期大小一致。通过草甘膦对表达细菌处理,表达菌对草甘膦的抗性显著提高。【结论】薤白EPSPs对草甘膦具有一定抗性。     

苎麻木质素合成酶CAD基因的cDNA克隆及表达分析

采用PCR结合RACE技术克隆苎麻栽培种湘苎3号CAD基因全长cDNA序列;再运用qRT–PCR技术对木质素含量不同的代表性苎麻品种湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻的CAD基因在其茎秆韧皮部和木质部的表达进行定量分析;使用1%间苯三酚和25%盐酸对4种苎麻茎横切片进行特异染色,观察品种间木质素染色度。结果表明,获得的苎麻CAD基因cDNA序列全长为1 378 bp(GenBank登录号,KF758396),编码359个氨基酸,推导为苎麻肉桂醇脱氢酶(BnCAD)。该推导蛋白质与已报道的几种植物木质素合成酶CAD的同源性均达90%以上,其中与蒺藜苜蓿的同源性达97%。运用qRT–PCR方法对BnCAD基因表达的定量分析结果显示,苎麻CAD基因在湘苎1号和湘苎3号的韧皮部表达水平明显高于其在木质部的表达水平,而在城步青麻木质部的表达水平高于其在韧皮部的表达水平,该基因在湘潭大叶白的韧皮部和木质部表达量接近。4种苎麻茎横切片的木质素染色结果表明,品种间木质素染色度与CAD基因在其韧皮部的表达量成正相关。     

巨峰葡萄查尔酮合成酶基因4的克隆及表达特性的RT-PCR分析

克隆了葡萄查尔酮合成酶基因4(CHS4),并采用半定量RT-PCR技术,以actin为内参,分析了CHS4在巨峰葡萄果实发育阶段不同组织的表达。对CHS4的序列分析表明:CHS4含有1个内含子,2个外显子;与CHS1、CHS2、CHS3在核苷酸水平的同源性分别为99.3%、92.6%和76.0%。半定量RT-PCR分析结果表明:CHS4在果皮、果肉、种子、叶片和根系中均有表达,在花后30d的果皮中表达强烈,随后迅速降低,到花后70d表达又增强;CHS4在花后30～45d的果肉中表达强烈,随后迅速降低;在花后45d的种子中也表达强烈,随果实发育,其表达逐渐下降。高温处理抑制CHS4在巨峰葡萄幼叶中的表达,但诱导CHS4在幼根的表达。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SotSPSB的克隆及原核表达

【目的】克隆甘蔗B家族s0心PsB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础。【方法】在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列。扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue－2上导入大肠杆菌BL21（DE3）中表达。【结果】通过比对B家族中进化关系很近的玉米（Zeamays）ZmSPS1和水稻（Oryzasativa）OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因（SolSPSB）2330bp序列。结合5’－RACE和3’－RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225bp的开放阅读框（0I江）;起始密码子（ATG）位于转录起始位点后56bp处,终止密码子（TGA）后有一段201bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm—SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94．7％和81．3％,氨基酸序列同源性分别为96．0％和83．9％;其理论分子量Mw=118．96kDa,等电点pI=6．30。经原核表达后纯化获得带6xHis标签的融合蛋白。【结论】克隆获得甘蔗B家族Sol-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SoPSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达

[目的]克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础.[方法]在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列.扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.[结果]通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa) OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB) 2330 bp序列.结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225 bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56 bp处,终止密码子(TGA)后有一段201 bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96 kDa,等电点pI=6.30.经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白.[结论]克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.     

雷竹纤维素合成酶基因cDNA克隆与表达分析

根据绿竹纤维素合成酶(cellulose synthase)基因的保守区序列设计引物,以雷竹cDNA为模板,采用PCR方法,成功扩增出1个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为3 385 bp,共编码1 056个氨基酸,将其命名为PpCesA1基因.氨基酸序列的分析结果表明,PpCesA1与其他纤维PeCesA4素合成酶有较高的同源性,同绿竹序列相似性高达94% ,且其序列具有典型的Cellulose_synt-GT-A 结构域,推测此PpCesA1为雷竹纤维素合成酶基因.对雷竹不同组织采用半定量方法研究该基因的表达情况,结果表明该基因在不同组织中的表达有明显差异.     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

白背飞虱海藻糖合成酶基因的克隆及序列分析

为进一步深入研究白背飞虱的迁飞能力与能量代谢,利用同源克隆及RACE的方法,从白背飞虱Soga-tella furcifera中克隆获得海藻糖合成酶基因(TPS)的全长cDNA序列(Genbank登录号:JQ013797),该基因全长为3 278bp,包含353bp的3非编码区域(UTR)和501bp的5UTR,开放阅读框(ORF)为2 424bp,编码807个氨基酸。该基因预测的蛋白分子量为90.372kD,等电点为6.08,有3个预测的糖基化位点,无信号肽及跨膜结构。进化分析结果表明:白背飞虱的海藻糖合成酶与其它昆虫的海藻糖合成酶基因的同源性较高,与褐飞虱相比较同源性高达98%。     

鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

PRRSV新疆株N基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已发表的毒株,设计了一对引物扩增PRRSV新疆株N基因片段;将N基因克隆到pMD18-T,在亚克隆到pGEX-6p-1原核表达载体上,构建重组质粒pGEX-6p-N;在37℃条件下,经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导表达4h后,获得了可溶性融合蛋白;经SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析,该融合蛋白分子量约为39kDa,与预期结果一致,并能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,且非特异性背景很低。     

月季MYB基因cDNA全长克隆和表达分析

 【目的】克隆月季花色代谢相关新基因的全长cDNA序列,并分析其表达功能。【方法】根据月季花色突变体SSH文库分析得到的差异表达EST序列设计引物,采用RACE技术进行全长cDNA克隆。【结果】克隆到1 125 bp的cDNA全长,GenBank登录号为Eu082130。这一cDNA序列编码1个包含294个氨基酸的前体蛋白,它与小金海棠MxMYB1和大豆的GmMYB176 蛋白的保守区同源性分别为70%和58%,都是只有1个MYB结构;而与具有两个MYB结构域的棉花GhMYB26、拟蓝芥AtMYB305和金鱼草AmMYB340同源性很低。该蛋白的分子量为32.33 kD,等电点为9.65,分子式为C1387H2201N435O440S10 。半定量PCR 分析证实了该RhMYB1基因与CHS基因在红花突变体中比在黄花亲本中表达量高。【结论】推测该基因是一个转录因子,参与调控花青苷的合成。     

溴代十六烷基吡啶对月季切花的保鲜作用

[目的]探讨季铵盐化合物溴代十六烷基吡啶（CPB）对夏季月季鲜切花瓶插期间保鲜状况的影响。[方法]分别检测蒸馏水（对照）、30g/L蔗糖＋0.25g/L柠檬酸＋0.3g/L8-HQS（处理Ⅰ）、30g/L蔗糖＋0.25g/L柠檬酸＋0.3g/L8-HQS＋0.1g/LCPB（处理Ⅱ）瓶插液中微生物浓度,并且测定了各组月季鲜切花水分、衰老等生理指标和观赏价值。[结果]与不含CPB的处理Ⅰ相比,保鲜液中添加0.1g/LCPB（处理Ⅱ）瓶插液中微生物密度降低66.5%,花冠直径增大0.86cm,观赏寿命延长3.70d,切花后期的水分平衡和鲜重能较好地维持,花瓣衰老减缓。[结论]CPB作为可降解的杀菌剂对夏季月季切花具有较好的保鲜效果。     

月季花瓣丝氨酸蛋白酶基因RhSep1的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR技术,从切花月季品种"Samantha"中克隆丝氨酸蛋白酶基因RhSep1。利用生物信息学技术对所得到的丝氨酸蛋白酶RhSep1序列进行结构与功能预测。结果表明:RhSep1基因全长2 442 bp,开放阅读框编码769个氨基酸,推定该丝氨酸蛋白酶分子质量为80.48 kD。通过NCBI和MEROPS肽酶数据库等对Rh-Sep1进行Protein Blast,发现RhSep1具有肽酶S8₃家族SA的典型结构域Petidase_S8₃（序列为Tyr-108-Leu-341）和PA_subtilisin_like的结构域（序列为Tyr-348-Ile-474）。预测RhSep1可能具有信号肽、明显疏水区和典型跨膜区,同时RhSep1氨基酸序列中存在较多蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、豆蔻酰化位点。这些活性位点往往与蛋白的磷酸化、G蛋白相互作用等信号转导事件有关,RhSep1可能存在复杂的蛋白水平调控机制。     

切花月季Samantha失水胁迫耐性与其超氧化物歧化酶之间的关联

 以探讨月季切花失水胁迫耐性与其超氧化物歧化酶(SOD)之间的关联为目的，选用耐失水胁迫品种Samantha，用DDTC(SOD专一性抑制剂)进行12 h预处理，之后在20℃、RH 35%～40%、80 Em-2·s-1光照（12h/d）条件下进行12～48 h的失水胁迫处理，然后进行瓶插观察。结果表明，20 mmol·L-1 DDTC预处理在显著抑制花瓣SOD活性的同时，明显减弱切花失水胁迫耐性，表现在切花弯颈率明显提高，复水率和水势值明显降低，瓶插寿命显著缩短。在花朵自然开放初期，花瓣MnSOD、FeSOD和Cu/ZnSOD这3种类型都存在。其中，MnSOD有1种，FeSOD有3种，Cu/ZnSOD有2种；迁移率大小依次为Cu/ZnSOD ＞FeSOD ＞MnSOD；谱带强弱依次为FeSOD＞Cu/ZnSOD＞MnSOD。经失水胁迫处理花瓣中诱导产生了3条新的FeSOD（FeSOD4、FeSOD5和FeSOD6）条带，与此同时MnSOD条带消失。DDTC预处理抑制了任何与上述失水胁迫诱导有关的新的条带产生。由此推测，切花月季Samantha失水胁迫耐性与其SOD活性相关，与FeSOD4～6的诱导产生相关联。     

碧冬茄花特异表达基因启动子PchsA的克隆与序列分析

根据Ingrid M．报道的碧冬茄花特异表达基因CHSA启动子的序列设计并合成一对特异引物，以碧冬茄总DNA为模板，通过PCR扩增出约370bp大小的DNA片段，回收后克隆到pUCm—T质粒载体上，经转化、筛选确定重组子，酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序，得到片段长度为370bp．采用DSgene分析软件进行序列分析发现其基本具有启动子的所有保守序列，TATAbox，CCAATbox，Anther box，G—box，TACPyAT box，box1，box2，Capsite等，且经InternetBLAST程序和DSgene分析软件进行同源性对比和序列分析，显示序列与已报道序列同源性为96％，登陆GenBank，ID号为AY360358。     

Direct Adventitious Bud Induction and Plant Regeneration of Rosa hybrida Samantha

Effect of explant, site of leaflet, induction period in the dark and combinations of plant growth regulators on direct adventitious bud induction and plant regeneration of Rosa hybrida Samantha was investigated. The results showed that after an induction period of 8 d on MS medium with 1.5 mg L-1 TDZ and 0.05 mg L-1 NAA in the dark and a subculture on MS medium with 0.5 mg L-1 BA and 0.01 mg L-1 NAA under light, the best plant regeneration was obtained and the regeneration frequencies of leaflets and petioles were 51.8 and 10% respectively. There was no significant difference in regeneration ability between leaflets at different sites of the compound leaves, longer time of induction in the dark or high concentration of auxin would cause callus formation, which was disadvantageous for shoot regeneration, and the regeneration frequency was significantly reduced. This regeneration system could be applied for genetic transformation of this cultivar in the future.     

保水剂在月季切花保鲜中的应用研究

为延长月季切花保鲜期,提高切花品质,采用保水剂浸沾月季切花枝叶,并对切花的蒸腾量、呼吸速率以及保鲜期等进行测定与观察。结果表明:用保水剂处理不同开放度的月季切花,可减少日蒸腾量4.49%-28.54%,降低呼吸速率15.61%-25.49%,延长保鲜期2-6 d;随着花朵开放度的增大,用保水剂处理切花产生的效应逐渐降低。由此可见,选择开放度较小的月季切花并用保水剂处理其枝叶,是延长切花保鲜期,提高切花品质的有效途径之一,值得推广应用。     

苹果砧木山定子MbNas1的克隆、表达与亚细胞定位

以苹果砧木山定子(Malus baccata)为试材,根据小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)中克隆得到的尼克烟酰胺合成酶基因Mx Nas1(登录号:DQ403256)的全长序列设计特异引物,通过RT-PCR方法从山定子c DNA中克隆到Nas1基因并命名为Mb Nas1,该基因全长为978 bp。预测该基因可编码325个氨基酸,理论等电点为5.26,相对分子质量为36.09 ku。Real-time PCR结果表明,正常供铁(EDTA-Na Fe,40μmol/L)时,该基因在山定子水培苗的新叶、老叶、根、茎的韧皮部中均有表达,在木质部表达量较低;缺铁处理(4μmol/L)时,该基因在根和新叶中的表达加强,第6天达到最高值,之后开始下降;在老叶中表达逐渐减弱;高铁处理(160μmol/L)时,该基因在根和新叶中的表达减弱,在第9天达到最小值,之后有所上升;在老叶中表达逐渐增强。基因枪亚细胞定位试验表明,Mb Nas1蛋白质定位在细胞质膜上。     

月季萨蔓莎不定芽的直接诱导和植株再生的研究

 以月季品种萨蔓莎为试材研究不同外植体、叶片位置、暗培养时间和激素组合对月季不定芽诱导和植株再生的影响。结果表明，月季萨蔓莎在含1.5 mg·L－1TDZ和0.05 mg·L－1NAA的MS培养基上黑暗培养8 d后转入含0.5 mg·L－1 BA和0.01 mg·L－1NAA的MS培养基光下培养，再生效果最好，小叶外植体和复叶柄的再生率分别为51.8%和10%。小叶的叶位对植株再生无显著影响，暗培养时间过长，外植体易形成愈伤组织而不利于不定芽的分化，植物生长调节剂中生长素浓度升高易导致愈伤组织形成而影响植株再生。本研究所建立的不定芽直接再生系统可用于该品种的转基因遗传改良研究。     

不同切花月季品种花器官乙烯生成量和ACC含量时空变化

以切花月季品种‘天使’、‘唐娜小姐’和‘红成功’为试材,测定了花朵开放过程中整朵花以及花瓣、雄蕊、花柱、花托和子房、花萼5部分的乙烯生成量和ACC含量。结果表明,花朵的乙烯生成量变化类型主要取决于花瓣,品种间乙烯变化类型的区别也取决于花瓣。3个品种花朵不同部位乙烯生成量的变化趋势相近,都在花朵开放前期出现明显的峰值。花蕾发育早期,3个品种花瓣ACC含量占整朵花ACC总量的比例远低于乙烯生成量所占比例,而花器其它部位则相反,尤其是雄蕊的ACC含量极高而乙烯生成量却相对很低;在花朵开放后期,3个品种表现不同。推测,在花朵开放进程中花器其它部位可能向花瓣运输ACC,不同乙烯变化类型的品种可能在花器不同部位间ACC的运输分配上存在差异。