检测猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以感PCV2的PK-15细胞培养上清的DNA提取物为模板,分别扩增499 bp和131 bp的片段,建立了检测PCV2的TaqMan荧光PCR方法。结果表明:TaqMan荧光PCR检测PCV2的最佳探针浓度为0.5 pmol·μL-1;TaqMan荧光PCR两步法操作快捷,扩增131 bp的引物PCF1101/PCR1232检测敏感性高(3.17×102拷贝·μL-1),重复性好。在诸多检测样品中,除检测到PCV2检测指标出现阳性外,猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV),日本乙型脑炎病毒(JEV),猪伪狂犬病毒(PRV),猪瘟病毒(CSFV)及PK-15细胞等检测指标均为阴性,表明特异性强;与普通PCR的检测结果(2/10)比较,本法的敏感性和对临床样品的阳性检出率(3/10)更高。上述研究表明,本方法快速、敏感、特异,具有很高的重复性,且可实时监测,能有效检测PCV2。     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×10~3、4×10~3 copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性。该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(P0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于PCV1。【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中PCV2和PCV1的基因组序列设计3条引物,并建立了检测PCV2的复合PCR方法。用该方法对河南省7个地市45个猪场的156份样品进行了检测,检出阳性病料98份,阳性率63%;阳性猪场38个,阳性率84%,表明该方法特异性及敏感性高,可用于临床诊断。     

猪圆环病毒2型和猪细小病毒混合感染的PCR检测

2012年9月河南省新乡市某养猪场发生一例以初产母猪流产、死产,断奶仔猪精神沉郁、呼吸困难、食欲不振、轻微腹泻、渐进性消瘦为特征的疾病。采用PCR技术进行检测,结果表明猪圆环病毒2型和猪细小病毒均为阳性,结合发病情况、临床症状及剖检变化,初步确定为PCV2和PPV混合感染。     

猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2）,是感染猪Sus scrofa domestica的一种单链DNA病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法,对于PCV2感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计了荧光定量聚合酶链式反应（PCR）引物,利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法。结果表明:该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,每微升的最低检测限低至101拷贝DNA。利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测,检测符合率为100%,明显高于普通PCR方法的50.0%。因此,本研究建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法为该疾病的预防和控制提供一种有效的检测工具。图4表4参26     

检测猪圆环病毒2型DNA的套式PCR方法的建立及应用

为了进一步调查研究PVC2的流行病学及其致病机制,根据猪圆环病毒2型GD株及已发表的PCV2的全基因组序列,对来自广东、广西、湖南、海南等地287个猪场送检的1 560个可疑病料进行PCR扩增,并对扩增产物进行克隆、酶切、测序鉴定,建立了PCV2检测的套式PCR方法.结果表明,PCR扩增获得了预期大小的片断,将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在90%以上.该PCR方法对PCV2是特异的,并具有良好的重复性和稳定性.用该PCR方法对287个猪场的1 560份样品进行了检测,其中983份为PCV2阳性,表明该病在我国广泛流行.     

猪圆环病毒2型和3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的方法,参照GenBank上已登录的PCV2 Cap基因和PCV3 Cap基因的保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR检测方法,并对其进行特异性、灵敏性、可重复性检验.特异...     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。     

猪圆环病毒PCR检测方法的建立

本研究建立了检测猪圆环病毒的PCR方法,并对该方法进行了标准化研究.该方法具有快速、敏感、特异性强等特点,从PCV2感染的细胞中町最低扩增到0.1 ng的DNA,且对其它病原微生物如PRV、PPV不能检出.可对病料、血清提取DNA进行检测,所有程序在5 h内得出结果.该方法可用于PCV2感染猪的快速诊断,引种检疫,分子流行病学调查.     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

检测猪圆环病毒2型的一种PCR方法

参照genbank已发表的猪圆环病毒2型的基因序列，设计l对2型特异的引物，对广东省20个猪场送检的患病断奶仔猪的病料进行PCR扩增，并将PCR产物连接到pMDl8-T载体上，对重组质粒进行PCR、酶切鉴定及测序，最后发现PCR检测均为阳性。     

猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF1基因的扩增测序与序列分析

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株(ZZ株)猪圆环病毒PCV-2型的ORF1基因进行了扩增,经测序后,将所测序列与已公布的35株PCV-2ORF1序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株间的ORF1基因核苷酸同源性为97.3%～100%;进化树分析表明各分离毒株ORF1基因在进化上比较保守。同时对PCV-2OFR1部分功能进行分析,发现该基因蛋白具有良好的抗原性。     

PRV和PCV2二重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)2种病毒的多重PCR,设计2对PRV和PCV2特异性引物,建立同时检测这2种病毒的二重PCR方法,并对采自呼吸障碍病猪的病料进行检测。结果表明,PRV和PCV2扩增产物分别为359bp和482bp,最小DNA质量分别是2.7pg和4.3pg。采自河南省的80份样品的总阳性率为85%(68/80),其中PRV和PCV2阳性率分别为28.8%(23/80)和77.5%(62/80),混合感染率达25%(17/68)。该多重PCR检测方法敏感、特异、快速,可用于临床样品PRV和PCV2检测。     

应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究

[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查.     

猪圆环病毒多重PCR检测与分型

[目的]建立一种快速的PCV诊断方法,并能将2种PCV病毒区分开来,提供兽医临床和相关产品快速监测PCV的手段。[方法]根据genebank上公布的PCV1和PCV2序列,设计2对引物扩增PCV1和PCV2非同源性区域,建立快速检测PCV2个血清型的多重PCR,用已知的PCV1和PCV2及其他病毒细菌检测其敏感性和特异性。[结果]结果表明:所建立的方法特异、敏感,最低能检出0.02 ng的PCV1和PCV2混合DNA,用该法检测已知阳性病料和不同来源的猪血清,阳性符合率达100%。[结论]所建立的MultiplexPCR可用于PCV2个血清型的临床快速检测。     

猪环状病毒2型的PCR检测方法的建立及应用

根据国外已发表的猪环状病毒2型（PCV－2）的全基因组序列，设计一对2型特异性引物，对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD18－T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中，经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定，证明扩增出了PCV－2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV－2序列进行比较，发现同源性均在90％以上。用该PCR方法在43份可疑病料中检测到了12分PCV－2阳性病料，表明该病在我国已有流行。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。