风信子DFR基因全长cDNA的克隆及序列分析

以蓝色风信子完全露出蓝色的花蕾为材料,利用RT-PCR和RACE技术,获得风信子DFR基因的全长cDNA。该cDNA全长1252 bp ,开放阅读框为1098 bp ,编码366个氨基酸。 Blast搜索结果显示,风信子DFR基因核苷酸序列与其它植物已报道的DFR基因具有66 %～77 % 的相似性,氨基酸序列有62 %～73 %的相似性。聚类分析表明, 最先与风信子聚类合并的是鸢尾,其次与其它单子叶植物聚类,最后与双子叶植物聚类。     

疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列克隆与分析

从已构建疣粒野生稻消减cDNA文库中随机挑取阳性单克隆经测序得到ESTs, 通过生物信息学分析, 选取与泛素结合酶具有同源功能的EST以RACE技术分离克隆到1个疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列, 命名为OmE2 (Oryza meyerianaBaill. ubiquitin-conjugating enzyme, OmE2), 该序列长917 bp, 最大开放阅读框为528 bp, 编码的蛋白具有175个氨基酸, 该蛋白的分子量为19.31 kD, 理论等电点为9.32。OmE2蛋白与其他物种的泛素结合酶具有高度的一致性和相似性, 含有泛素结合酶活性位点的保守序列及半胱氨酸残基, 且具有3个跨膜结构域, 推测OmE2是一类泛素结合蛋白兼跨膜蛋白。经RT-PCR分析, OmE2基因是受白叶枯病病原菌胁迫诱导表达的, 是首次从野生稻中发现的可能参与疣粒野生稻胁迫信号传导和抗病应答反应的基因。     

一个陆地棉半胱氨酸蛋白酶全长cDNA的克隆及其序列特征分析

植物体内的半胱氨酸蛋白酶（CP）在一系列重要的生理代谢途径中发挥作用,在种子萌发过程中它们与许多贮藏蛋白的降解有关[1],它们可能催化大多数蛋白前体向成熟蛋白转化过程中的翻译后加工过程[2,3],从而为幼苗的生长发育提供营养物质;……     

河北毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

植物巯基蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitor,CPI)在林木的抗虫基因工程中发挥着越来越重要的作用,分离和克隆植物CPI基因进而研究该基因的功能是CPI基因工程研究的热点.本文应用PCR技术从我国乡土抗天牛树种河北毛白杨形成层中分离和克隆到了一个710bp大小的cDNA片段,同时对序列进行测定和分析.测序和分析结果表明,该cDNA片段含有一个429 bp的完整开放阅读框,其编码143个氨基酸残基,具有LARFAVDEHN、QXVXG和YEAKVWVKPW三个典型的植物巯基蛋白酶抑制剂基因家族的高保守区段,同时在GenBank中进行了注册,核苷酸注册号为DQ020096,氨基酸注册号为AAY41807.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木中的巯基蛋白酶抑制剂的同源性差异较大,同源性在48%～97%之间,其中与欧洲山杨的同源性最高,达到97%,与猕猴桃的同源性最低为48%.说明河北毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达,这为进一步研究该基因的抗虫功能奠定了良好的基础.     

羊驼垂体催乳素（PRL）基因全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]获得并分析羊驼PRL基因cDNA全序列结构,为研究羊驼催乳素（PRL）的各种生物学作用和生产应用提供理论依据。[方法]根据已知的不同哺乳动物的PRL基因cDNA序列,设计羊驼PRL引物,运用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得羊驼PRL基因cDNA全序列。[结果与结论]羊驼PRL基因cDNA序列全长959bp,编码区为687bp,编码229个氨基酸的PRL前体蛋白。预测羊驼PRL蛋白质的空间结构类似人生长激素（GH）,但在81位（成熟肽为51位）为蛋氨酸可能导致蛋白空间结构的不同而影响羊驼PRL的功能;序列比对结果表明,羊驼PRL的 cDNA序列与大多数哺乳动物相似。构建的基因进化树分析结果显示,羊驼PRL与骆驼的亲缘关系最近;同多数哺乳动物一样,羊驼PRL进化速度极缓慢,没有发生人、灵长类、啮齿类、反刍动物的“episodic”式进化。     

牡丹类psDHN-YSK2基因全长cDNA的克隆与表达分析

为了获得牡丹类脱水素基因的全长cDNA序列,推测其在休眠解除进程中的生物学功能,以不同低温处理时间的牡丹花芽为供试材料,末端快速扩增方法克隆全长cDNA序列,实时定量PCR分析其表达模式。结果表明牡丹类脱水素基因全长cDNA序列为1187 bp,包括831 bp的开放阅读框,114 bp的5’非编码区和242 bp的3’非编码区。其编码的蛋白具有两个植物脱水素蛋白特征性K片段,根据Close的分类方法,属于YSK2类脱水素蛋白。系统发生分析表明psDHN-YSK2基因与葡萄亲缘关系最近。在花芽内休眠解除前期随着低温处理时间的延长psDHN-YSK2表达呈上调趋势。本研究克隆了牡丹psDHN-YSK2的全长cDNA序列,分析了其在花芽内休眠解除过程的表达趋势,暗示了其参与了牡丹花芽的内休眠过程。     

油茶CoUXS1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

为了揭示油茶UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因的序列特点和结构功能,为该基因的深入研究和开发应用奠定基础。根据油茶种子EST文库中调取的UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因序列,设计特异引物,利用RT-PCR技术获得该基因全长cDNA克隆,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：该基因阅读框为1032 bp,编码344个氨基酸,具有典型的UXS家族模体序列。与海岛棉GhUXS3基因亲缘关系最近,定位于细胞质,有较强的亲水性,将该基因命名为CoUXS1,GenBank登录号为JN017094。     

芽孢杆菌蛋白酶基因apr的克隆、 表达及序列分析

【研究目的】克隆从新疆吐鲁番地区土样分离获得产蛋白酶菌株Bacillus tequilensis C9蛋白酶基因apr,建立蛋白酶基因异源表达体系。【方法】采用PCR技术克隆获得目的基因,利用生物信息学软件进行序列分析,构建pET-28a原核表达重组质粒,转化BL21大肠杆菌,37℃下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活。【结果】蛋白酶基因apr全长1098 bp,与Bacillus subtilis aprE (AB734697)有98%的同源性,编码含有299个氨基酸残基的成熟蛋白,是易溶、亲水性较强的蛋白,属于Peptidases_S8_S53 superfamily蛋白家族,融合蛋白分子量为29 kDa,蛋白酶酶活为28.4 u/mL。【结论】试验为构建蛋白酶基因高效表达体系奠定理论基础。     

革胡子鲶生长激素全长cDNA 的克隆与序列分析

通过RT-PCR和RACE-PCR的方法,克隆了革胡子鲶生长激素基因全长cDNA,其长度为973 bp,包含一个603 bp的开放阅读框架(Open reading frame,ORF),59 bp的5′非编码区和311 bp的3′非编码区(含PolyA 尾25 bp).将革胡子鲶GH cDNA的ORF、5′非编码区和3′非编码区的序列分别与同为鲶形目印度囊鳃鲶、巨鲶鱼、南方鲶和鲶的上述序列进行比对分析,结果表明:革胡子鲶与上述鱼类生长激素ORF的核苷酸与氨基酸序列同源性较高,平均值分别为91.2%和96.4%,ORF区核苷酸的碱基替代类型表现出T/C转换的偏向性,平均值为44.5%,同时表现出转换/颠换偏差,平均值为2.381.5′和3′非编码区序列同源性平均值分别为75.4%和77.0%,保守性低于编码区.     

擎天凤梨泛素基因的克隆与序列分析

鉴于泛素与植物受高温等环境胁迫下产生的一些诱导型蛋白降解有关,本研究根据擎天凤梨Ostara早期花器的全长cDNA文库,经大规模随机测序及重叠群（contigs）内EST序列的拼接,获得了擎天凤梨多聚泛素基因全长cDNA序列（GenBank登录号：GQ890686）,序列长1896bp,开放阅读框长1323bp,编码441个蛋白氨基酸残基,蛋白质分子质量为49.3kD,等电点pI为6.59。蛋白二级结构预测显示,该蛋白主要由随机卷曲、延伸链、α螺旋和β-转角组成;系统进化树分析表明与拟南芥推定的多聚泛素UBQ10（gi｜23397122｜gb｜AAN31845.1｜）亲缘关系最近;经推断它是由5个单体泛素组成的多聚泛素。本研究有助于进一步探讨该基因在低温胁迫下的反应机理以及如何采用分子调控手段增强擎天凤梨的耐低温能力。     

猪MAPK12基因cDNA的克隆及序列分析

目的 克隆新的猪MAPK12基因全长ORF，分析其生物特性，为进一步研究该酶的功能提供信息资料。方法：以已报道的人及小鼠MAPK12基因cDNA序列为依据，利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物，RT-PCR技术扩增新的猪MAPK12基因ORF序列，将PCR产物直接进行序列测定。分析此蛋白的特性并预测其结构。结果 分离的ORF全长1101bp，编码367个氨基酸，与人鼠氨基酸序列92%同源；利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其一级、二级和高级结构。结论 研究分离的基因片段可命名为猪ERK6，通过分析，获取了该酶的基本信息特征，并与现有的报道结果进行对比分析，为进一步开展猪MAPK12基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E. coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79% ,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank (Accession. EF624459)     

鸭梨多酚氧化酶基因cDNA全长的克隆和生物信息学分析

为了从分子水平深入了解鸭梨多酚氧化酶结构特点,基于已知的鸭梨多酚氧化酶基因cDNA片段序列设计引物,以鸭梨果实总mRNA为模板,对该基因cDNA 5’端和3’端未知序列进行了RACE扩增,最终获得鸭梨多酚氧化酶基因cDNA全长序列。该序列长度为2126 bp,开放性读码框位于136~1917 bp之间,可编码593个氨基酸残基。对该基因所翻译的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明基因编码的多酚氧化酶属酪氨酸酶超级家族成员,三级空间结构为可溶性球状蛋白,不具备跨膜结构,在细胞中的定位应该位于类囊体腔中。这些生物信息的获得将为今后应用生物技术开展鸭梨多酚氧化酶的调控从而抑制鸭梨果实褐变提供十分重要的参考资料。     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

小麦小G蛋白Tarab5B基因全长cDNA克隆及表达特性的初步分析

通过对白粉病菌诱导的小麦叶片cDNA文库的测序,获得1个与水稻Rab5B基因一致性达89%的序列.以该序列为信息探针,筛选小麦EST数据库并进行电子拼接.根据拼接结果设计引物,利用RT-PCR方法获得了1个小麦中尚未鉴定的全长cDNA克隆Tarab5B.Tarab5B基因编码的蛋白具有结合GTP/GDP的4个保守结构域以及Rab家族成员所特有的结构域.同源分析表明,该基因属于Rab5B亚族.麦类Rab5B蛋白的GDSGVGKS、DTAGQE、NKAD、ETSA和MGCSSS 5个结构域在进化上非常保守,而YYRGA结构域及其邻近的C端6个氨基酸残基在小麦材料间同源性很低.RT-PCR检测显示,抗、感两个材料Tarab5B基因在接种后24 h和未接种24 h的表达水平基本相同;在接种后1 h、4 h、7 h、12 h,抗、感两个材料间Tarab5B基因的表达水平有一定差异.     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

马铃薯SoFtsH基因全长cDNA克隆与在干旱条件下表达研究

FtsH (Filamentation Temperature-Sensitive H)是一种ATP和Zn²⁺依赖型金属蛋白酶,广泛存在于原核生物和真核生物中,在真核生物中是多基因家族。FtsH具有ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性,参与多种胁迫反应。从抗旱马铃薯（Solanum tuberosum）二倍体品系H145中分离得到cDNA-AFLP差异片段,利用RACE技术克隆了SoFtsH cDNA全长序列, 并对其进行分析。结果表明, 该序列包含完整的开放阅读框,长为723 bp, 编码129个氨基酸。SoFtsH具有2个铁氧化还原蛋白结合位点,并存在信号肽序列、跨膜区域和Zn²⁺结合域。SoFtsH基因序列与GenBank数据库中的其他FtsH基因进行同源序列比对, 并构建系统进化树, 发现该基因与番茄、烟草、拟南芥等高等植物FtsH基因同源性达90%以上。半定量RT-PCR和Northern Blot杂交结果表明SoFtsH基因在干旱胁迫下叶片和根系里的表达量明显增加, 且在抗旱品系H145与干旱敏感品系H214中表达模式不同。说明SoFtsH基因在马铃薯抗旱中起作用。