适合甜菜品种鉴定的SRAP核心引物的筛选

为筛选适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物,以12个进口国外甜菜品种为材料,对546对SRAP引物组合进行扩增,利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,选择适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物组合。结果从546对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、重复性好的引物组合23对,这23对引物组合共扩增出177条多态性条带,引物的PIC值均大于0.6。平均每对引物扩增7.7条多态性条带,从理论上讲,这些核心引物完全可以实现对现有甜菜品种的鉴定。     

适于甜菜品种鉴定的SSR核心引物的筛选

为了筛选出适合于甜菜杂交种鉴定的核心引物,以16个在中国种植面积较大的进口甜菜品种为材料,对已公布的130对甜菜SSR引物以及70对甜菜EST-SSR引物进行筛选。结果从200对甜菜SSR引物中筛选出了24对扩增条带清晰、重复性好且多态性高的核心引物。这24对引物中有22对引物的PIC值大于0.5,其中7对引物的PIC值均大于0.8,可以作为甜菜品种鉴定的首选核心引物。利用筛选出的核心引物对16个甜菜品种进行聚类分析,结果16个品种分为3类,基本上是同一公司的品种聚在了一起。甜菜SSR核心引物的筛选将大大加速甜菜品种纯度和真实性鉴定的速度,也将更快的促进甜菜分子生物学其他领域的发展。     

甜菜SCoT核心引物的筛选

【研究目的】为了筛选出适合甜菜品种遗传多样性分析的SCoT引物,为SCoT引物得以在甜菜中进行深入应用奠定基础,本研究甜菜以8个来自不同国家的甜菜品种为材料对80条SCoT引物进行扩增【方法】扩增方法采用SCoT-PCR最优反应体系包含2.0 μL的10×PCR buffer（含Mg2+）、10 ng的DNA、0.5 U的Taq DNA聚合酶、10 μmol/L的引物2 μL以及0.1 μL的dNTPs (2.5 mmol/L each)。【结果】结果从80条SCoT引物中筛选出20条多态性高的引物,这20条引物最多扩增出16条多态性条带,最少扩增出2条多态性条带,扩增总条带155条,其中多态性条带为134条,多态性条带的百分比为86.5%。【结论】通过对核心引物的有效性验证,表明筛选出的20个核心引物非常适合用于甜菜指纹图谱的构建。     

适合棉花品种鉴定的SSR核心引物的筛选

本研究利用来自Cotton Marker Database(CMD)数据库中的2 000个引物对32份审定棉花品种基因组DNA进行了PCR扩增,筛选出26个多态性核心引物,其中11个引物被推荐为棉花品种鉴定的首选核心引物,同时提出了核心引物理论上可区分的最大品种数的计算公式:N=G1x…xGn,理论推测结果表明:利用11个首选核心引物进行棉花品种鉴定是可行的.建立在SSR指纹数据基础上的不同组合品种(系)间聚类分析以及对25份区试品系和A品种的真实性鉴定,结果表明:所有参试品种(系)遗传基础狭窄,32份审定品种间DNA水平上的差异与品种来源的系谱分析结果基本吻合,首选核心引物不仅可以对品种(系)的真实性做出鉴定,而且对遗传距离狭窄的品种(系)具有很好的鉴别力.     

甜菜CDDP核心引物的筛选及利用CDDP引物鉴别甜菜品种

为了研究CDDP引物在甜菜育种上的应用,选用12个甜菜品种对35条CDDP引物进行筛选。随后,利用筛选的引物对43个甜菜登记品种进行鉴别。结果显示35条CDDP引物中有10条引物可以作为甜菜品种真实性鉴定的核心引物。这些引物扩增的条带具有清晰、易于识别、多态性高的特点,普遍分布在50~400 bp之间。其中,引物KNOX-3就可以鉴别全部43个甜菜品种。引物MADS-1和F3’H4的组合也可以鉴别全部的43个品种。甜菜CDDP核心引物的筛选,对于将来利用CDDP引物鉴别甜菜品种、对甜菜种质资源进行分类,为有效维护农民、育种家以及糖厂的利益提供了理论和技术上的支持。     

甜菜EST-SSR引物的快速筛选

为了快速从甜菜EST-SSR引物中筛选出适合甜菜分子生物学的引物,利用12个不同的甜菜品种对80对甜菜EST-SSR引物进行扩增,同时设置12个不同的退火温度,利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行分离。结果表明：80对EST-SSR引物虽然均能够扩增出产物,但绝大部分引物扩增的条带由于没有多态性或者条带难以辨别而不能够使用,只有13对引物扩增出了清晰、易于识别的条带,有4对引物多态性较高,其余9对引物多态性均较低,而梯度退火温度则表明,退火温度对EST-SSR引物影响不大,只有个别引物会在较低退火温度条件下产生非特异性的条带,因此将所有引物的退火温度均设定为60℃。利用不同品种以及梯度退火温度可以实现EST-SSR引物的快速筛选,但要想筛选出多态性高的引物还需要对更多的EST-SSR引物进行筛选。     

不同检测方法对甜菜ISSR引物多态性的影响

为了探讨不同检测方法对甜菜ISSR引物扩增效果的影响以及各方法的优缺点,笔者应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳两种检测方法对甜菜ISSR 引物扩增效果进行了检测。利用12个不同的甜菜品种,对10 个ISSR引物进行扩增,分别采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、1%的琼脂糖凝胶电泳以及2%的琼脂糖凝胶电泳对ISSR-PCR的扩增产物进行分离。结果表明：6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳无论是检测的总条带数还是多态性条带数均远高于琼脂糖凝胶电泳,且条带清晰,易于识别,而2%的琼脂糖凝胶电泳检测的条带数高于或等于1%的琼脂糖凝胶电泳,且条带更易于识别,因此,对于利用ISSR 引物进行QTL定位、指纹图谱构建以及遗传多样性分析时,推荐使用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,而对于种子纯度鉴定以及需要对ISSR扩增产物进行测序,则推荐使用2%的琼脂糖凝胶电泳。     

百合种质资源ISSR标记研究的引物筛选

为筛选出适合于百合种质资源ISSR标记研究的有效引物,利用58个ISSR引物,对百合属的卷丹、川百合、西伯利亚和索邦进行PCR扩增,共筛选出11条多态性丰富、条带清晰且可重复性好的有效引物,11条引物在4个样品中共扩增出125条DNA带,其中108条为多态性带,占总扩增带数的86.4％,平均每个引物扩增出11.4条带.该研究结果为应用ISSR标记技术进行百合属植物遗传多样性分析和品种分子鉴别等研究奠定了基础.     

基于ISSR和AFLP标记开发甜菜 SSR 引物的研究

本研究以ISSR-PCR和AFLP标记原理为基础,介绍一种新的分离甜菜基因组微卫星引物的方法。首先对甜菜基因组DNA进行酶切并连接已知序列的接头,构建基因组DNA酶切文库,同时用一个或两个ISSR引物,扩增文库中两端含微卫星序列片段并进行克隆测序,根据测序结果设计微卫星序列间的IP1引物和IP1与微卫星序列间IP2 引物;再根据侧翼序列克隆原理,采用巢式PCR进行基因组步移,扩增IP2引物下游序列,根据巢式PCR产物测序结果,设计微卫星序列另一侧的引物IP3 ,IP2和IP3即为SSR标记引物,对获得的SSR引物进行PCR验证,结果表明SSR引物产率为16%,本研究获得的SSR引物具有较高的多态性,对于后续的遗传多样性检测和遗传连锁图构建具有重要意义。     

云南岩白菜资源的DNA提取和ISSR引物筛选

提取滇产岩白菜资源的基因组DNA并进行ISSR引物的筛选,为用ISSR标记研究云南岩白菜资源的遗传多样性奠定基础。DNA提取采用改良的CTAB法,质量检测采用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计法,ISSR引物选用加拿大哥伦比亚大学开发的100条引物。结果表明,从18份云南岩白菜资源的幼叶中提取了基因组DNA,浓度在1 387.5～12 000 ng/μL之间,A260/A280的值在1.61～1.85之间,琼脂糖凝胶电泳检测呈一条带;从100种ISSR引物中筛选出了22种扩增结果好的引物。所提DNA质量较高,该提取方法适用于从酚类和蛋白质含量高的植物材料中提取DNA;22个ISSR引物可用于岩白菜资源的遗传多样性研究。     

国产糖甜菜品种SSR指纹图谱的构建

为了构建14份国产甜菜品种的指纹图谱,利用6个差异较大的甜菜品系对50对SSR引物进行筛选,共选出7对多态性高、带型清晰、重复性好的SSR引物。利用这7对SSR引物对国产14份糖甜菜品种进行扩增,共获得40条谱带,其中多态性位点28个,多态性比率达75%;每对引物产生的等位基因数为5-8个,平均6.6个。利用其中三对引物S6,S13和BVGTT6构建了14份国产甜菜品种的DNA指纹图谱,结果表明,每个甜菜品种有唯一的数字指纹区别于其它品种,说明SSR标记适用于甜菜品种纯度和真实性的鉴定,同时甜菜品种指纹图谱库的构建也为将来可能出现的甜菜品种纠纷打下坚实的技术基础。     

马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选

本试验主要对AFLP反应体系进行优化,并用该体系筛选适用于马铃薯种质资源遗传多样性分析的引物。酶切连接、预扩增和选择性扩增体系的优化结果表明,建立的马铃薯AFLP反应体系为:模板DNA160ng,37℃酶切连接12h;预扩增体系中dNTP浓度为0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1U;选择性扩增体系中预扩增产物稀释20倍,引物终浓度为2.5ng/μL。利用优化后的AFLP反应体系,以5个马铃薯品种为试材筛选选择性引物,可以从81对引物组合中选出16对条带丰富且多态性较高的引物组合。本研究为种质资源鉴定、马铃薯遗传多样性以及马铃薯抗病性研究等奠定了良好的基础。     

适合于狗尾草属遗传分析的ISSR标记筛选及反应体系优化研究

利用公共数据库已有的ISSR序列信息,检验了29条ISSR引物在谷子等狗尾草属植物基因组的扩增性,其中14条在狗尾草属中有良好扩增,其余15条在狗尾草属中无任何扩增。能稳定扩增的14条引物全为3'-锚定引物,6条5'-锚定引物在狗尾草属中得不到扩增。研究发现AG,GA和CA重复的引物在狗尾草属植物有较好扩增,且多态性强。利用正交试验设计,从Mg2 、dNTP、引物、Taq酶4种因素、4个水平对狗尾草属谷子ISSR反应体系进行优化,确定了适合谷子的ISSR反应体系,在20μL体系中,含1×PCR buffer、Mg2 浓度2.0 mmol/L,dNTP浓度0.25 mmol/L,Taq酶0.4μL,引物浓度0.25μmol/L,50 ng模板,通过梯度PCR确定了引物的退火温度。本研究筛选的ISSR引物及建立的优化反应体系可用于谷子等狗尾草属植物遗传多样性和基因组研究,并对其他近缘作物有指导意义。     

甜菜DAMD引物的筛选及不同凝胶系统对扩增产物多态性的影响

为了筛选适宜于甜菜品种纯度鉴定的DAMD引物,笔者利用12 个不同的甜菜品种分别对26 条DAMD引物进行扩增,并分别采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳和2%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。结果表明,从26 条DAMD引物中筛选出16 条扩增清晰的引物,这16 条引物共扩增出139 条带,其中多态性条带为122 条,多态性百分比为87.7%,这16 条引物可以作为甜菜品种纯度和真实性鉴定的核心引物,同时发现聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳的检测结果差异不大,而琼脂糖凝胶具有制作方便、检测简单以及不使用任何有毒药剂等优点,推荐甜菜DAMD扩增产物的检测使用琼脂糖凝胶电泳。     

适用于玉米DNA指纹库构建的SSR核心引物的重新设计与优化

为了确定出适用于玉米DNA指纹库构建的引物,对部分并不是完全符合玉米DNA指纹库构建引物筛选原则的引物进行重新设计与优化,使其基本符合核心引物设计的要求.以umc2105、umc1705和phi299852为例,下载原引物的基因组序列,利用两个常用的引物设计软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.57进行引物的重新设计及评估,在Tm值、GC含量、引发效率、错误引发率、3'端G值、引物二聚体等方面对引物进行改善,结果表明,经过对原引物的重新设计和优化,新设计的引物均能清晰的扩增,扩增效果得到了明显的改善,并且均能在统一的条件下进行实验,符合了玉米DNA指纹库构建的要求.