插入T-DNA片段构建部分水稻突变体株系

 通过农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将T-DNA片段高效插入水稻中花11的基因组DNA中。利用二次枝梗种子和未成熟种子的盾片愈伤组织作为转化起始物,探索并优化了影响愈伤组织诱导率、再生率和转化率的试验条件,得到近10 000株转化植株。经PCR分析和Southern 杂交证明已将外源基因整合到水稻基因组中。当代转基因植株可抗0.2%的除草剂Basta。200余棵T0代转化株系出现白化苗、宽叶、狭叶、黄叶、高秆、矮化并杂草化、不育、白化穗、皱穗和抽穗延迟等突变表型,结实率普遍较低     

水稻T-DNA插入氮营养缺陷型突变体的氮营养特征

利用营养液培养试验,研究水稻T-DNA插入氮营养缺陷型突变体的氮营养特性.结果表明,氮营养缺陷型突变体突变植株硝态氮和铵态氮吸收速率均低于原始亲本,植株氮含量及硝酸还原酶活性降低,氮同化能力下降,根系变短,根系体积及根系活跃面积变小,植株变矮.     

T-DNA插入产生的水稻小粒突变体遗传分析

[目的]研究水稻粒形突变体的遗传特性及其在水稻遗传改良中的作用。[方法]筛选水稻T-DNA插入纯合体,鉴定表型变异,通过表型突变的遗传分析及其与T-DNA插入共分离的检测,研究水稻表型突变的遗传特性。[结果]观察到1个粒形突变体T56。主要表现为粒长变短、粒宽变窄及千粒重降低;对该突变体进行遗传分析,分离群体出现野生型和突变体2种类型,其分离比符合3∶1,表明该突变体表型受1对隐性基因控制。突变体及其后代分离群体的Basta抗性检测和PCR分子检测结果表明,该突变体由T-DNA插入所引起,突变性状与T-DNA共分离。[结论]该材料可用于插入座位的基因克隆和水稻遗传改良的种质资源。     

一个水稻T-DNA插入类病斑突变体的初步研究

从T-DNA插入突变体中筛选到一个类病斑突变体AZT91,主要表现为生长缓慢、植株矮小、叶片出现条状褐斑,最后死亡。对突变体及其后代分离群体进行潮霉素抗性检测,证明该突变体是由T-DNA插入突变引起的,突变性状与T-DNA共分离。PCR和TAIL-PCR分析进一步证明了上述的观点。利用TAIL-PCR扩增了左边界侧翼序列,通过分析,初步推测该突变体可能是由于T-DNA插入后激活了单加氧酶基因的过量表达,破坏正常代谢途径,导致突变体死亡。该材料可用于水稻代谢调控机理的研究。     

T-DNA插入产生的水稻小粒突变体的遗传分析(英文)

[Objective] The aim of this study is to understand the genetic characteristics of a grain shape mutant and its possible role in genetic improvement of grain yield in rice. [Method] On the basis of the collection of T-DNA tag lines, the progeny of homozygous plants carrying T-DNA insertion were screened for mutants with mutated phenotypes. The genetic analysis of the mutant and test for the linkage between the mutated phenotype and the T-DNA insertion were carried out to determine its genetic characteristics. [Result] In the present study, a grain shape mutant induced by T-DNA insertion in rice was identified, which showed small grain. Genetic analysis of the mutant showed that the two types of phenotype, normal and small grain in the segregating populations derived from the T-DNA heterozygotes, fit the ratio of 3∶1. Test for Basta resistance showed that all the mutants were resistant while the normal plants segregated for resistant and susceptible by the ratio of 2∶1. The results indicated that the mutant phenotype cosegregated with Bar gene. The small grain mutant caused by T-DNA insertion was confirmed by PCR amplification aiming at T-DNA. [Conclusion] The grain shape mutant is useful for isolation of the tagged gene and genetic improvement in rice.     

稻曲病菌分生孢子高产突变体A2588的T-DNA 插入位点侧翼基因分析

【目的】克隆稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）分生孢子高产突变菌株A2588的T-DNA插入突变基因,解析该基因在稻曲病菌分生孢子形成中的功能,为进一步揭示稻曲病菌的分生孢子形成机制提供理论基础。【方法】测定A2588的产分生孢子能力、孢子萌发率、菌丝直线生长能力和热敏感性等生物学特性,利用hiTAIL-PCR、RACE和半定量PCR等方法克隆T-DNA插入突变基因,并结合生物信息学方法分析T-DNA插入导致分生孢子产量提高的分子机理。【结果】与稻曲病菌野生型菌株70-22相比,突变菌株A2588在PS培养液中产生数量为10倍以上的分生孢子,在MM培养液中产生数量约20倍的分生孢子,其在PS培养液中培养的菌球较为致密;在PSA和MM固体培养基上A2588产孢周期较短,孢子萌发率较低,虽然菌丝生长速度无明显差异,但热处理后菌丝不能恢复正常生长速率。hiTAIL-PCR和RACE法克隆了A2588中T-DNA侧翼基因,并利用RT-PCR检测侧翼基因表达水平,结果表明T-DNA侧翼基因spo76表达水平下降,进一步分析发现T-DNA可能插入至spo76的启动子区域,从而破坏了该基因启动子的部分功能。【结论】稻曲病菌突变菌株A2588中,T-DNA插入导致spo76启动子功能部分缺失,spo76表达水平下降,可能使A2588产孢周期缩短,并产生更多分生孢子。     

拟南芥T-DNA插入突变体scc8-D的蛋白质组学研究

采用双向凝胶电泳对拟南芥T-DNA插入突变体scc8-D和对照材料cry1cry2的植株总蛋白进行了分离,通过考染显色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱.然后选取30个差异蛋白质点用MALDI-TOF-TOF-MS进行肽质谱指纹图分析,有22个蛋白质点得到了可靠鉴定.其中在scc8-D突变体中有3个蛋白上调,16个蛋白下调,有3个蛋白仅在cry1cry2中表达.分析发现,这些差异蛋白可能参与了碳水化合物代谢、光合作用、光呼吸、胁迫响应、蛋白质合成和氧化还原平衡等过程.这些蛋白中光合蛋白占32%,说明这些与矮化相关的调节性蛋白和功能性蛋白丰度的表达受到光的调控,从而抑制了植物下胚轴的伸长.     

空间诱变绿豆长荚型突变系的分子生物学分析

中绿1号绿豆种子于1994年经返回式卫星搭载后,经过3年的地面种植和筛选得到了基本稳定的长英型突变系,该突变系荚长16cm左右,每荚种子粒数为15～19粒。通过对3个形态和荚长都基本稳定的突变系和原始对照品系之间的RAPD分析,从100个10-mer Operon引物中筛选出3个能产生稳定的遗传多态性的引物,其特异扩增产物分子量依次为1.4kb、1kb、2kb,因此分别命名为OPZ-13#-（1400）、OPY-07#-（1000）、OPY-04#-（2000）。OPZ-13#-（1400）和OPY-07#-（1000）的克隆和鉴定工作已经完成,其中OPY-07#-（1000）转换成了稳定的SCAR标记。3个突变系进行RAPD分析,彼此之间没有发现扩增产物的差异,它们与原始对照之间却有着共同的差异,表明长荚型突变品系在DNA分子水平上已接近同源。     

Identification of T-DNA Inserted Mutant Gene Transcription by Using Real-time PCR in Arabidopsis

AtERF4 (ethylene response factor) is a negative regulator in jasmonic acid mediated signal transduction pathway and ethylene mediated signal transduction pathway of Arabidopsis. It could respond to abscisic acid (ABA) and ethylene stimulus. ATSYR1 gene encodes a syntaxin localizing at the plasma membrane in Arabidopsis, which can be induced by abiotic stress. To identify mutation lines for gene functional analysis, real-time PCR was employed to detect the expression level of AtERF4 and ATSYR1 in homozygous ...     

拟南芥At2g23470基因T-DNA插入突变体的鉴定

At2g23470是拟南芥功能未知结构域DUF647蛋白家族的一个成员。为了研究At2g23470基因的功能,需要获得At2g23470功能缺失的突变体材料。根据拟南芥信息资源网站(The Arabidopsis Information Resource,TAIR)上公布的At2g23470基因可利用的T-DNA标签品系,从美国拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC)购买了2套独立的At2g23470基因的T-DNA插入GABI-Kat株系种子,运用PCR法对这些T-DNA插入突变体进行了基因型分析和鉴定,结果获得了3个纯合的T-DNA插入位于RUS4启动子上的株系和1个T-DNA插入位于第2外显子的株系。RT-PCR分析表明,T-DNA插入位于第2外显子的株系中,At2g23470基因的表达完全缺失。该突变材料的获得为深入研究At2g23470基因的功能奠定了良好的基础。     

拟南芥atcwinv1基因T-DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察

以拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体和野生型植株为材料,比较研究了2种基因型植株在营养期和生殖期的形态差异.结果表明:拟南芥atcwinvl 基因T-DNA插入纯合突变体(简称突变体)较野生型萌发率平均下降5.88个百分点;突变体在44 d抽薹,较野生型延后4d;分支数平均4支,较野生型下降20.84...     

稻曲病菌T-DNA插入突变菌株B1241侧翼基因克隆

【目的】分析稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)致病力减弱的T-DNA插入突变菌株B1241的生物学性状和致病力,并结合分子生物学手段研究其T-DNA插入位点的侧翼基因,以解析突变基因在稻曲病菌生长和致病过程中的作用,从而为阐明稻曲病菌致病机制提供理论基础。【方法】以野生菌株P1作为对照,观察并检测突变菌株B1241的菌落形态、生长速率、孢子形态、产孢量等生物学性状;采用注射接种的方法将菌丝和孢子的混合液接种于水稻穗苞中,统计每穗发病的病粒数,分析B1241的致病性变化;突变菌株B1241在不含有潮霉素的PSA平板上转接5代之后,PCR检测T-DNA插入的稳定性并通过Southern杂交分析B1241中T-DNA插入的拷贝数;利用HiTail-PCR获得T-DNA插入位点的侧翼序列,经NCBI比对得到侧翼基因;运用RACE-PCR克隆插入位点侧翼基因全长;qRT-PCR分析侧翼基因的表达情况。【结果】经生物学特性观察及田间接种发现,与野生菌株P1相比,突变菌株B1241在固体培养基MM、PSA和TB3上的菌落和孢子形态以及生长速率无显著差异,其致病力、产孢能力均呈极显著下降。B1241在不含潮霉素的PSA平板上转接5代之后,仍能扩增到GFP和HPH基因,说明T-DNA已经稳定地插入到其基因组中。Southern杂交结果显示T-DNA在该突变菌株中以单拷贝的形式插入。经扩增并比对侧翼序列,T-DNA的插入位点处少了28 bp的稻曲序列,有37 bp在T-DNA及稻曲病菌基因组中都没有比对到。NCBI比对发现,侧翼基因Uvt-1241与UV-8b菌株的UV8b-7878基因同源,开放阅读框长2 317 bp,包含81和106 bp的2个内含子,编码709个氨基酸。经RACE-PCR获得基因全长2 650 bp,5'非编码区长度为14 bp,3'非编码区长度为319 bp。T-DNA插入在基因Uvt-1241的启动子区域,位于起始密码子之前516 bp处。qRT-PCR分析结果表明,Uvt-1241在该突变体中表达量下降。该基因编码一个糖基水解酶18家族的蛋白,同时含有一个保守结构域D××D×D×E。【结论】稻曲病菌突变菌株B1241中,T-DNA插入到基因Uvt-1241的启动子区域,从而导致该启动子功能部分缺失,基因表达量下降,使得突变菌株的生长、产孢等生物学特性及致病力发生改变,由此推测该基因可能在稻曲病菌生长及致病过程中起着重要的作用。     

T—DNA诱发的小麦强分蘖突变体研究初报

利用农杆菌介导的小麦活体转化技术转化多个小麦品种,得到一定数量的小麦转化体植株。在小麦品种鲁麦21的遗传转化体T0代植株中发现一强分蘖突变体,通过PCR技术和Southern杂交技术证明该突变体含有T-DNA序列;该突变体表现为单基因隐性突变,在突变体T3代中均能通过PCR扩增到T-DNA内的序列,表明该突变体为T-DNA插入诱发的突变体。通过对该突变体初步分析表明突变基因与温度应答有关,随温度的降低,突变体分蘖速度加快。     

棉花T—DNA标签雄性不育突变体的遗传分析

利用农杆菌介导T—DNA插入得到棉花雄性不育突变体,与野生型陆地棉（Gossypium hirsutum L）Coker 312杂交得到F1代。F1代植株出现了不育与可育两种性状的分离,分离比是1：1。对F1代进行形态学观察、卡那霉素和除草剂抗性鉴定、PCR扩增检测以及遗传学分析,证实雄性不育突变性状的表现与T—DNA插入共分离,从而认为突变是由T—DNA插入引起的显性杂合突变,这为利用T—DNA标签法进行雄性不育有关基因的克隆奠定了基础。     

稻瘟菌T-DNA插入突变体的培养基筛选试验

采用3种培养基进行稻瘟菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr,无性世代为Pyricularia oryzae（Cooke）Saccard。]菌落生长及产孢条件的分析。结果表明,在相同条件下,3种培养基中以PDA琼脂培养基最适宜于稻瘟菌突变体的生长,在产孢培养条件观察中也发现,PDA琼脂培养基中的突变体产孢效果最好。     

稻瘟菌若干T-DNA插入突变体初步分析

为揭示稻瘟菌致病分子机制,创建了该菌T-DNA插入突变体库．部分突变体经表型分析,获得3个生长发育及致病性同时发生变异,5个生长发育正常但致病性变异及2个生长发育变异但致病性正常的突变体；以TAIL-PCR方法获得了这些突变体T-DNA插入位点及其边界序列,并用生物信息方法对被T-DNA标签的基因进行了分析,为进一步研究这些基因的功能提供了重要信息．     

EMS诱导辣椒“6421”突变体库的构建及矮秆突变体的鉴定与分析（英文）

[目的]为促进辣椒的遗传改良,以6421为试验材料,建立辣椒突变体库。[方法]采用不同浓度的EMS溶液(0.2%~1.2%)处理6421种子,确定半致死剂量,并构建突变体,并对M4代中获得的矮秆突变体进行农艺性状调查与遗传分析。[结果]EMS浓度为1.0%时,种子发芽率和出苗率分别为45.2%和40.2%,种子发芽指数和生活力分别为17.6和19.7,接近半致死;取经半致死浓度处理的种子10,000粒构建突变体,2015年在M_4代中共获得562份能稳定遗传的突变体,突变性状可分为11大类32小类;矮秆突变体E29,E58,E142和E312的株高、株幅、主茎粗、主茎长以及主茎节位数均显著低于对照植株,E58侧枝数显著高于对照植株;E29,E58和E312突变性状均由单隐性基因控制。[结论]该研究首次成功地构建了辣椒突变体库,不仅为辣椒育种提供了丰富的种质资源,还为开展辣椒基因组学研究提供了有用的试验材料。     

火龙果矮化突变体的遗传分析

为了给火龙果的突变机制提供新信息,通过 ISSR 标记、DNA 甲基化及检测赤霉素（GA3）含量等方法,对火龙果矮化突变体（D）及其回复突变体（R）进行遗传分析。结果表明：对比野生型（WT）,D 和R 均带有不同程度的刺座突变,同时均对 GA3敏感,其中 D 的 GA3含量极显著低于 WT,推测其为 GA3缺陷型的矮化;筛选到3条有多态性差异的 ISSR 引物,D 与 WT 存在有4个位点的差异,R 与 WT 未找到差异位点;D 的甲基化程度比 WT 高2．8％,而 R 的甲基化程度比 WT 低约0．9％。     

EMS诱导辣椒“6421”突变体库的构建及矮秆突变体的鉴定与分析

[目的]为促进辣椒的遗传改良,以“6421”为试验材料,建立辣椒突变体库.[方法]采用不同浓度的EMS溶液(0.2％～1.2％)处理“6421”种子,确定半致死剂量,并构建突变体,并对M4代中获得的矮秆突变体进行农艺性状调查与遗传分析.[结果]EMS浓度为1.0％时,种子发芽率和出苗率分别为45.2％和40.2％,种子发芽指数和生活力分别为17.6和19.7,接近半致死;取经半致死浓度处理的种子10,000粒构建突变体,2015年在M4代中共获得562份能稳定遗传的突变体,突变性状可分为11大类32小类;矮秆突变体E29,E58,E142和E312的株高、株幅、主茎粗、主茎长以及主茎节位数均显著低于对照植株,E58侧枝数显著高于对照植株;E29,E58和E312突变性状均由单隐性基因控制.[结论]该研究首次成功地构建了辣椒突变体库,不仅为辣椒育种提供了丰富的种质资源,还为开展辣椒基因组学研究提供了有用的试验材料.