牛卵母细胞体外培养成熟前后及体外受精卵Alpabe的电镜细胞化学研究

本研究用Adams的改良柠檬酸铅法,对牛卵巢2—5mm卵泡中的细胞及体外培养成熟卵和体外受精卵进行了碱性磷酸酶(AIpcse)的电镜细胞化学研究、其Alpase活性有一定的变化规律。培养前的卵母细胞酶活性较强,主要定位于质膜及质膜下颗粒细胞突起膨大部和透明带上。体外培养成熟卯质膜上的酶活性明显减弱颗粒细胞突起已抽回。但是在增宽的卵周隙中有较多的酶反应产物。体外受精卯的酶活性很强,不仅表现在质膜上的酶活性增强,而且还定位于线粒体及一些空泡的膜和细胞基质中。可见,Alpase的活性随牛卵母细胞的成热过程减弱,随受精过程增强。     

牛卵泡卵母细胞的体外成熟培养

1997- 12～ 2 0 0 1- 0 8共进行了 97批牛卵母细胞体外成熟试验 ,总成熟率为 70 .75 % (35 6 1/ 5 0 33)。其中培养液为 TCM199+0 .12 g/ L 丙酮酸钠 +10 mm ol/ L Hepes+体积分数 8% NCS+10 mg/ L FSH+10 mg/ LL H+1mg/ L E2 (培养液 1组 )组进行 5 0批试验 ,成熟率为 6 5 .75 % (14 15 / 2 15 2 )。培养液 1组有 5批次未添加 Hep-es 盐 ,其成熟率为 75 .2 1% (88/ 117) ;另 4 5批次添加 Hepes盐 ,成熟率为 6 5 .2 1% (132 7/ 2 0 35 )。培养液为TCM199+体积分数 8%发情牛血清 +0 .12 g/ L 丙酮酸 (培养液 2组 )组进行 4 7批次试验 ,成熟率为 74 .4 9%(2 14 6 / 2 881)。培养液 2组中有 9批次添加了 4 0 m g/ L 的庆大霉素 ,其成熟率为 72 .15 % (342 / 4 74 ) ;另 38批次未添加庆大霉素 ,其成熟率为 74 .95 % (180 4 / 2 4 0 7)。试验同时表明 ,激素来源对卵母细胞成熟率无显著影响     

牛卵泡卵母细胞体外成熟的研究

研究了ＦＣＳ,１７β－Ｅ２,ＦＳＨ,ＬＨ对牛卵泡卵母细胞成熟的作用及培养时间对卵母细胞和细胞质成熟的影响。结果表明,添加体积分数为１０％－１５％的ＦＳＣ,１－２ｍｇ．Ｌ＾－１１７β－Ｅ２,２０－５０ｍｇ．Ｌ＾－１ＬＨ和１０ｍｇ．Ｌ＾－１ＦＳＨ有利于提高卵母细胞核成熟,放出第一极体。而成熟培养２０,２４ｈ的卵母细胞成熟率显著高于培养１６ｈ,核成熟后培养３－４ｈ有利于卵母细胞质成熟,对其后的受精,卵型     

牛卵泡卵母细胞体外成熟的研究

研究了ＦＣＳ,１７β－Ｅ２,ＦＳＨ,ＬＨ对牛卵泡卵母细胞成熟的作用及培养时间对卵母细胞核和细胞质成熟的影响。结果表明,添加体积分数为１０％～１５％的ＦＣＳ,１～２ｍｇ·Ｌ－１１７β－Ｅ２,２０～５０ｍｇ·Ｌ－１ＬＨ和１０ｍｇ·Ｌ－１ＦＳＨ有利于提高卵母细胞核成熟,放出第一极体。而成熟培养２０,２４ｈ的卵母细胞成熟率显著高于培养１６ｈ（Ｐ＜０．０５）,核成熟后培养３～４ｈ有利于卵母细胞质成熟,对其后的受精、卵裂及胚胎的进一步发育有重大影响。且ＴＣＭ１９９＋质量分数１０％～１５％的ＦＣＳ＋１～２ｍｇ·Ｌ－１１７β－Ｅ２＋１０ｍｇ·Ｌ－１ＦＳＨ＋２０～５０ｍｇ·Ｌ－１ＬＨ是卵母细胞成熟的理想培养系统。     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

牛卵丘－卵母细胞复合体体外成熟前后超微结构

实验用透射电镜技术研究了牛卵立－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）体外成熟前后卵母细胞、卵丘细胞及它们之间联系的结构特征．体外培养前,卵母细胞微绒毛数量较少,有的伸入秀明带中;各种细胞器集中分布于皮质区,形成“细胞器带”;核膜可打褶,核仁致密化．卵母细胞与卵丘细胞间及卵丘细胞之间形成间隙连接;卵丘细胞中线粒体致密、形态多样．成熟培养后．微绒毛增多．卵周隙形成;高尔基复合体消失,脂滴伴随着线粒体内迁．少数线粒体转变为幼稚型,皮质区形成“细胞器游离带’;皮质颗粒开始沿质膜下呈线状排列,但有的仍成团分布;排出第一极体处无微绒毛．中期赤道板附近无细胞器;卵丘细胞间及卵丘细胞与卵母细胞间联系中止;卵丘细胞中线粒体转变为幼稚型．     

牛卵母细胞体外成熟及体外受精的研究

本研究分析了卵巢不同性周期阶段（卵泡期、黄体期）、外源激素（ＦＳＨ、ＬＨ、雌激素）和不同卵泡液浓度（１０％,２０％,３０％）对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明,卵巢的不同性周期阶段对卵母细胞体外成熟的影响不大（６３９％和５８７％）;成熟培养基中添加ＦＳＨ（１０ｍｇ／Ｌ）,ＬＨ（５ｍｇ／Ｌ）和同时添加ＬＨ、雌二醇（１ｍｇ／Ｌ）,可以促进卵母细胞的体外成熟,成熟率分别为６３０％,６４０％,６９１％;卵泡液（１０％,２０％,３０％）代替血清,其成熟率分别为５０７％,５７６％,５１９％,２０％ｂＦＦ效果最好。本研究对精子的两种处理方法进行了比较,发现在相同精子密度条件下（１×１０６～２×１０６个／ｍＬ）,Ｐｅｒｃｏｌ液处理精子的受精率（４７１％）显著低于上浮法处理精子的受精率（５７１％）（Ｐ＜００５）。     

牛卵巢卵母细胞体外成熟的研究

研究了卵巢采卵方法以及卵巢保存温度和时间、性周期阶段、激素和培养基对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:从屠宰场获取的卵巢,先切剖或抽吸卵泡再切割卵巢,可显著提高可用卵母细胞数。卵巢保存时间在 2 h 以内最好,最长不超过 6 h。30~39 ℃的生理盐水保存卵巢,卵母细胞的成熟率(63.9 %)和卵裂率(34.4 %)均显著高于 2~8 ℃(16.7 %、0 %)和 20~29 ℃(54.1 %、31.7 %)保存的。采集卵母细胞时卵巢所处性周期阶段(卵泡期、黄体期)对卵母细胞体外成熟的影响不大(成熟率分别为 69.2 %、64.3 %)。M199 是牛卵母细胞体外成熟理想的培养基,M199 + 50 IU/mL LH+ 100 IU/mL FSH + 1μg/mL 17?-E2和 M199 + 50 IU/mL GnRH+1μg/mL 17?-E2都是牛卵母细胞体外成熟理想的培养系统(成熟率分别为 69.4 %、67.5 %,卵裂率分别为 35.4 %、42.7 %)。     

猪体外成熟,受精卵的体外培养研究

用自己改良的发育培养基使３．９％￣２０．１％体外成熟体外受精卵在体外发育过了４－细胞阻滞期，到达８￣１６－细胞期，个别发育到桑椹期；培养中还观察到葡萄糖对猪胚胎的体外发育没有抑制作用，说明葡萄糖不是猪胚胎体外培养中出现阻滞的原因，在培养基中添加ｐＦＦ可促进猪胚胎体外发育，使发育至８￣１６－细胞期的胚胎率从３．９％，提高到１０２．２％。     

中国黄牛卵巢卵母细胞体外成熟与体外受精的研究

自屠宰场和临时屠宰的黄牛体内取卵巢2批共25次,黄牛97头,共得可用卵巢卵母细胞657个。用TCM—199加雌激素(FSH、LH、雌二醇—17β)培养于5％CO_2与95％空气的39℃的CO_2培养箱中,使第1批成熟率达到55.04％,第2批成熟率达到61.7％。第1批受精率达到61.97％,移于兔输卵管中发育到卵裂,移于羊输卵管中发育到晚期桑桩胚和早期囊胚。第2批废卵率为38.3％;第10次的体外培养发育率为23.8％;羊输卵管培养发育率达到91％。利用肝素(0.005mg/ml)使精子获能,授精时的精子浓度为25×10~6/ml。用小滴培养法(小滴量为50μl)加盖无菌石蜡培养。结果证明中国老龄黄牛的卵巢还是有利用价值的。     

猪卵母细胞的体外成熟

取自猪卵巢含卵丘细胞且胞质均匀的、胞质不均匀和不含卵丘细胞胞质均匀３类卵母细胞，台盘蓝染色的存活率分别为１００％，１０％和４０％，３者差异极显著。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４种培养液培养的成熟率分别为１６．２％，６１．５％，５５．２％，４１．５％，差异极显著。Ｅ，Ｃ，Ｆ３种培养液培养的成熟率分别为３５．５％，４７．８％，５２．６％，在Ｅ培养液中加入ＰＭＳＧ和Ｅ＿２能显著地提高成熟率。Ｃ液与卵泡液［加入２×１０￣（－６）ｍｏｌ／（Ｌ·ｓ）ＦＳＨ］培养的成熟率分别为５０％，４４．４％，受精后的卵裂率分别为１６％，１０％，成熟率、卵裂率间均无显著差异。卵母细胞体外成熟培养３６，４０，４４ｈ后授精，其相应的受精率分别为２６．７％，４４．４％，４５．８％；卵裂率分别为０．３０％，２０％；以培养４０，４４ｈ的效果稍好，但三者差异不显著。     

猪体外受精技术中生殖细胞体内外成熟及获能的比较

猪体内、外成熟卵子与体外获能精子进行受精，其卵裂率分别为４３．６％和１９．６％，两者差异极显著。体内获能精子与体外成熟卵子进行受精，其受精率和卵裂率分别为５５．０％和２２．５％，增高于体外获能精子组的水平，但差异都不显著，体内获能精子不能经受常规的精子冷冻程序。     

家兔卵巢卵母细胞体外成熟和体外受精的初步试验

从家兔卵巢卵泡中抽取卵母细胞,用含有FCS、BSA-V、HCG的TCM-199液和KRB修正液于37～39℃、5％CO_2、5％O_2和90％N_2的湿润环境中成熟培养和体外受精。试验以TCM-199液为基液,第一组加入PMsG10Iu/ml,第二组加入HcG10Iu/ml,第三组加入PMSG5Iu/ml、HCG5Iu/ml,第四组加入PMSG10Iu/ml、HCG5Iu/ml。结果表明:培养40小时后,4组卵丘细胞扩展率分别为80.65％、86.00％、85.40％和85.71％,组间差异不显著(P<0.05)。第一极体放出率分别为16.47％、7.14％、12.89％和19.23％。第二组低于其他各组,但差异不显著(P>0.05)。用体外获能的精子授精,卵裂率分别为26.96％、17.39％、32.35％和39.17％。授精后29～30小时出现2-细胞;44～45小时出现4-细胞;56小时出现8-细胞胚胎。     

猪卵泡卵母细胞体外受精研究

采用３种获能方法（常规获能法、肝索获能法、钙离子载体获能法）进行猪冷冻附睾精子的体外获能研究，其相应的受精率分别为４２．５％，３２．０％，３０．８％，卵裂率分别为１８．６％，１５．７％，１６．１％。受精率、卵裂率间均无显著差异。精子与ＳＭＴ－ＰＧＨ基因质粒混合培养后引起卵裂率下降，实验组的卵裂率（７．５％）显著地低于对照组的水平（２１．０％）．３９℃与３７℃下受精，其受精率分别为３８．８％。１８．７％；多精受精率分别为８９％，３０．７％；卵裂率分别为２６．９％，３．７％，３９℃组的受用率、卵裂率均显著高于３７℃组水平，而多精受精率则极显著地低于３７℃组。发育培养液Ａ液、Ｂ液中的卵裂率分别为２４．３％，１３．０％，两者无差异。在兔输卵管内培养猪体外受精卵，卵裂率为４６．７％，极显著地高于对照组水平（１０．９％）．受精卵体外培养１６～１７ｈ后离心，可观察到１８．４％的原核形成率，这与受精卵体外培养的卵裂率（１９．５％）相当。     

猪卵巢卵母细胞体外成熟与体外受精的研究

 自屠宰场取猪卵巢825个，得卵母细胞8346个，将其分为3类。分类后卵母细胞在含有pFF或PMSG的TCM-199培养液中于5%CO#-2、95%空气、饱和湿度、39℃下培养36小时。成熟卵母细胞用前培养法加肝素或咖啡因获能的鲜精，以2×10#+5/ml的精子密度体外受精。在授精12-17小时以后，一些受精卵以手术法移至受体母猪输卵管中，另一些则更换BMOC-2培养液继续体外培养。3类卵母细胞间的成熟率与卵裂率有明显的差异。成熟培养液中加入PMSG和pFF，可明显提高卵母细胞成熟率（67.7%:17.8%）和桑椹胚率（6.5%∶2.8%）用笔者的培养液，有些胚胎成功地越过4细胞阻断而获得了猪的纯体外培养桑椹胚（1990.5）。移入受精卵的9头母猪，有3头妊娠，其中1头于1990年9月产5头仔猪。离子测定结果显示不同离子（Na、Ca、Cl、K）在精子某些部分、卵母细胞和受精卵的表面分布有明显改变。RMP检测指出培养前A类和部分B类卵母细胞为负值，C类和剩余部分B类为正值。培养后不同时间3类卵母细胞RMP差异明显，说明其代谢水平强弱不一。受精后皆为负值，说明物质代谢比受精前更为活跃。     

促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响

在成熟液中同时添加不同浓度(0.25～2.0μg/mL)FSH和不同浓度(0.25～2.0μg/mL)LH,探讨这2种促性腺激素结合使用对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,当FSH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL及LH的添加浓度为0.25～2.0μg/mL时,猪卵母细胞的核成熟率极显著高于没有添加FSH和LH的对照组(P<0.01),而FSH和LH不同浓度组合之间对猪卵母细胞核成熟影响差异不显著(P>0.05)。结果表明,成熟液中同时添加0.25μg/mLFSH和0.25μg/mLLH便能极显著地促进猪卵母细胞的核成熟率,国产FSH和LH用于猪卵母细胞体外成熟研究是可行的。     

超排山羊卵巢卵母细胞体外成熟的初步研究

对超排山羊卵巢卵母细胞进行体外成熟培养的初步研究:试验一,分别用6、7、9、16号针头抽吸2～6mm卵泡,获有用卵母细胞百分率:分别为61.67％(37/60)、65.92％(178/270)、56.73％,(59/104)、31.43％(22/70);试验二,以TCM 199+10mol/L MHEPES+青霉素(6μg/m1)+链霉索(5μg/ml)为基础培养液(BM),再分别加入不同成分,配成5种卵母细胞成熟液:(A)BM+10％EGS(发情羊血清),(B)BM+10％EGS+HCG(2.5μg/ml,),(C)BM+10％EGS+HCG+E,(1μg/ml),(D)BM+10％FCS+HCG十E_2; (E)BM+10％EGS+HCG+E_2+颗粒细胞(1.5×10~6～3.0×10~6个/ml)。在38.5℃,5％CO_2培养26h,排卵后第1天卵巢母细胞体外成熟率分别为67.67％(20/30),60.42％(29/48),83.67％(41/49),67.79％(40/59),80.82％(59/73),排卵后第5天卵巢卵母细胞,在培液D中体外成熟率为71.43％(45/63)。研究表明,超排山羊卵巢卵母细胞经体外成熟可获得大量廉价的成熟母细胞。