兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A)型三联灭活疫苗研制

对 5批兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病三联灭活疫苗进行了动物试验 ,结果表明该疫苗安全有效。近期效检对兔病毒性出血症的保护率为 1 0 0 % ,对兔多杀性巴氏杆菌病保护率为 92 % ,对产气荚膜梭菌病 (A)型保护率为 88%。在免疫期试验中 ,免疫 6个月后 ,对兔病毒性出血症保护率为 1 0 0 % ,对多杀性巴氏杆菌病的保护率为 79% ,对产气荚膜梭菌病 (A)型的保护率为 88%。在保存期试验中 ,4～ 8℃保存 1年仍有效。     

一例兔产气荚膜梭菌的分离与鉴定

从滨州某兔场送检的病料中分离到1株兔产气荚膜梭菌,经细菌培养、形态学检查、生化特性鉴定、毒素中和试验鉴定为A型产气荚膜梭菌,易感试验兔接种试验能够复制出典型的病例。     

青岛地区兔源产气荚膜梭菌的分离鉴定及遗传多样性分析

兔的梭菌性肠炎是由产气荚膜梭菌感染引起的严重危害养兔业的一种疾病,为了更好地控制此病,本研究调查了青岛地区规模化兔场爆发此病时产气荚膜梭菌的毒素型及遗传多样性。2010年11月-2012年5月期间,采集青岛地区规模化养兔场疑似产气荚膜梭菌感染兔的肝脏进行产气荚膜梭菌的分离鉴定,采用Multiple—PCR方法对分离菌株进行毒素型分析,应用ERIC-PCR方法分析分离菌株的遗传多样性。共分离到25株产气荚膜梭菌,其中A型24株（96％）,C型1株（4％）。用ERIC—PCR方法将25株分离株分于9个聚类中,其中V型为主要流行型。结果表明：青岛地区规模化兔场中产气荚膜梭菌流行的毒素型主要为A型,且具有多种基因亚型,其中V型为主要流行型。此结果为该地区兔产气荚膜梭菌病的免疫和微生态防治提供了重要的参考依据。     

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定

试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI (irp2)及LEE (eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。     

多重PCR检测产气荚膜梭菌方法的建立及其临床应用

产气荚膜梭菌是牛羊猝死和肠出血症的重要病原之一。本研究根据其常见的A、B、C、D四种菌型菌株编码α、β和ε毒素的保守序列,分别设计合成了针对这3种毒素的特异性引物,建立了多重PCR检测不同血清型产气荚膜梭菌的技术方法。通过对参考菌株的分型检测表明,该方法不仅快速、客观,而且具有良好的特异性和敏感性。对羔羊猝死症中分出的菌株进行检测,确定其为产气荚膜梭菌A型和D型混合感染;对产后母牛血痢病料中分离的菌株进行检测确定其为产气荚膜梭菌A型。     

我国家兔危害严重疫病流行现状调查

2008～2010年期间,在我国华东、西南、东北、华南、华北、华中主要家兔养殖地区,调查兔场118个,存栏兔累计约126.56万只,对危害家兔生产严重的兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、支气管败血波氏杆菌病、产气荚膜梭菌病、球虫病、皮肤螨虫病、皮肤真菌病等疾病流行现状进行了调查。结果表明:兔病毒性出血症、支气管败血波氏杆菌病、产气荚膜梭菌病、得到了较好的控制,球虫病还存在一定的发病率,多杀性巴氏杆菌病和皮肤真菌病的发病率较高。     

A型产气荚膜梭菌滤液的质控标准研究

制备鸡传染性支气管炎病毒(IBV)血凝抑制试验抗原需用到A型产气荚膜梭菌滤液,拟建立A型产气荚膜梭菌滤液的质控标准。对29批A型产气荚膜梭菌滤液进行小鼠致死性、卵磷脂酶活性、处理IBV后其血液凝集活性和滤液最小加入量试验。结果显示,不同批滤液的小鼠最小致死量(MLD)及卵磷脂酶效价之间存在较大差异,但两者之间存在正相关关系,而这两者与处理后IBV的HA活性没有明显的相关关系。试验证明以小鼠最小致死量或卵磷脂酶效价作为滤液质控标准不可行,而以处理后IBV的HA活性作为滤液的质控方法,该方法简单可靠,可直接反映滤液使IBV产生血凝活性的能力。     

肉兔免疫程序

商品肉兔(70日龄出栏)兔病毒性出血症,多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗2毫升皮下注射35～40日龄或兔病毒性出血症(兔瘟)灭活疫苗2毫升皮下注射商品肉兔(70日龄以上出栏)兔病毒性出血症,多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗2毫升皮下注射兔病毒性出血症,多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗1毫升皮下注射或兔病毒性出血症(兔瘟)灭活疫苗1毫升皮下注射35～40日龄60～65日龄繁殖母兔(每年2次定期免疫)兔病毒性出血症,多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗2毫升皮下注射产气荚膜梭菌病(魏氏梭菌病)灭活疫苗2毫升皮下注射兔病毒性出血症,多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗2…     

羊源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定与进化树分析

无菌采取内蒙古通辽市某羊场病死羊肠道内容物、肝脏和肺脏,进行细菌的分离培养。将从十二指肠内分离到的1株疑似致病菌株进行生化试验、小鼠致病性试验,再将其通过魏氏梭菌多重PCR试验、魏氏梭菌ELISA试验及16S rRNA PCR试验进行鉴定。将PCR产物进行测序并进行了16S rRNA基因的进化树分析。结果显示,经细菌生化试验、多重PCR试验、ELISA试验和16S rRNA试验均证实此分离株为A型产气荚膜梭菌;进化树分析显示该菌与序列号为HQ808749.1(美国)的A型产气荚膜梭菌遗传距离最近。结果表明,该羊病例所分离的致病菌为A型产气荚膜梭菌。     

鹿出血性肠炎病原菌的分离和鉴定

通过对死于出血性肠炎的圈养鹿的病原菌进行分离鉴定,为研制产气荚膜梭菌β-毒素单价和多价疫苗奠定基础。采集山西省内不同地区鹿场因出血性肠炎而死亡鹿的病料32例,经病原微生物分离培养、生化试验和血清型鉴定,分离得到C型产气荚膜梭菌,并测定分离菌所产毒素对小鼠的最小致死量。PCR扩增C型产气荚膜梭菌β-毒素基因,构建重组质粒p MD18-T-J28-C,进行酶切鉴定和核苷酸序列分析。结果 32株分离菌中有6株是C型产气荚膜梭菌,占18.7%;其余均为A型,占81.3%。筛选出毒力最强的菌株J28-C,最小致死量(MLD)为5.0×105CFU/m L。PCR扩增和核苷酸序列分析表明,经PCR得到了特异性的β毒素基因片段。表明造成山西省鹿出血性肠炎的病原菌为A型和C型产气荚膜梭菌,以A型为主。     

规模化养鸡场A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其对海南霉素敏感性的测定

为探究海南霉素对产气荚膜梭菌的敏感性,在某大型养鸡场采集了209份鸡肠道样本,采用选择性培养基和MALDI-TOF质谱仪微生物鉴定仪鉴定,并对鉴定的菌株进行分型。采用琼脂稀释法测定了海南霉素、恩拉霉素、盐霉素、丁酸甘油酯对临床分离的产气荚膜梭菌的抗菌活性,以期为当前限抗禁抗后养殖场选择合适的药物控制产气荚膜梭菌提供理论依据。试验结果表明：共分离出61株产气荚膜梭菌,分离率为29.2%;通过多重PCR对所分离的产气荚膜梭菌进行分型,结果分离株均为A型产气荚膜梭菌;4种药物均有不同程度的抑菌效果,其中海南霉素与恩拉霉素对鸡源产气荚膜梭菌的抑菌效果最好,且MIC值范围均为0.004～0.06μg/mL。海南霉素具有很好的抗梭菌效果。     

兔魏氏梭菌病

魏氏梭菌病,又称兔产气荚膜梭菌(A型)病,是兔的一种急性致死性腹泻病,其发病率、死亡率均高,对养兔业的危害极大,造成巨大的经济损失。1 病原:魏氏梭菌即产气荚膜梭菌,一般可分为A、B、C、D、E、F六型。兔的魏氏梭菌病主要由A型引起,少数为E型。A型魏氏梭菌为革兰氏阳性大杆菌,两端稍钝圆,无鞭     

犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立

从12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了18株病原菌，经生化试验及毒素中和试验，确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列，设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2共6对分型毒素基因的引物，对以前昆明地区分离的1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增，结果扩增出了与预期大小相同的6个基因片段，分别为233、196、324、446、567和665 bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型，较细菌毒素检测方法快速，与细菌分离鉴定的结果一致。     

羊源产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中已发布的产气荚膜梭菌α,β,ε,ι毒素基因序列,设计并合成4对特异性引物,经过优化多重PCR反应条件,建立了检测产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR方法。特异性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型产气荚膜梭菌标准菌株均扩增出了相应的目的条带,而对诺维氏梭菌和腐败梭菌扩增为阴性;灵敏性试验表明,该方法对A,B,C,D,E型标准菌株基因组DNA最低检测量分别为9.0,17.8,12.2,13.8,18.5pg;重复性试验表明,该方法有很好的重复性。应用所建立的方法从21份羊临床病料中检测出9株A型和1株C型产气荚膜梭菌。本试验建立的多重PCR方法可以进行产气荚膜梭菌的快速检测及5种毒素型的鉴别。     

鲜猪肉中A型产气荚膜梭菌污染情况调查

对贵阳市部分市场销售的鲜猪肉A型产气荚膜梭菌的污染情况进行了调查，从被检肉样中分离获得3株A型产气荚膜梭菌，分离率为6．25％（3／48），表明贵阳市部分市场销售的鲜猪肉存在A型产气荚膜梭菌的污染，对消费者的健康构成潜在的威胁。     

动物源A型产气荚膜梭菌流行情况调查及α毒素基因分析

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原菌,在一定条件下可引起多种严重疾病。为了调查不同动物A型产气荚膜梭菌流行情况及α毒素基因同源性,本试验从不同地区共采集病料307份,其中鸡133份(包括肉鸡112份、蛋鸡21份)、鸭65份、犬31份、猪14份、兔子20份、小鼠9份、牛粪便18份、鸵鸟粪便17份。取肠道内容物和粪便进行产气荚膜梭菌分离鉴定和毒素基因分型,并检测cpe、β2毒素基因携带率;从不同地区、不同动物源A型产气荚膜梭菌分离株挑选18株进行α毒素基因扩增,将所得基因序列进行同源性比较。结果显示,307份样品中68份(22.1%)呈产气荚膜梭菌阳性,不同动物源产气荚膜梭菌阳性率介于5.9%～44.4%;68株产气荚膜梭菌分离株α毒素基因阳性率为100%,所有分离株毒素基因分型均为A型,未检测到cpe毒素基因,β2毒素基因总阳性率为63.2%;分离株与NCBI参考菌株α毒素基因相似性介于97.8%～100%。结果表明,不同动物α毒素具有很高的同源性,本调查为研发A型产气荚膜梭菌α毒素通用疫苗提供数据支持。     

一株致梅花鹿猝死症A型产气荚膜梭菌的分离与基因分型研究

对苏州某梅花鹿场 1头猝死梅花鹿进行了病原的分离与鉴定 ,在死亡鹿体内分离到 1株G+ 、无芽孢、有荚膜、粗大正直的杆菌。通过肠内容物毒素中和试验和多重PCR方法证明所分离到的细菌为A型产气荚膜梭菌。结合流行病学、临床症状和病理变化 ,证实A型产气荚膜梭菌为引起此例梅花鹿猝死症的病原     

牛出血性肠炎A型产气荚膜梭菌的分离鉴定

从新疆维吾尔自治区某牛场采集的3份疑似出血性肠炎病料中分离到8株产气荚膜梭菌,用PCR扩增保守基因16SrRNA,并进行序列测定和同源性分析,再通过多重PCR方法扩增型特异性基因进行分离菌株的分型鉴定。结果显示,所分离的8株产气荚膜梭菌之间16S rRNA基因同源型为100%,与GenBank参比序列同源性在99.8%以上,确定为产气荚膜梭菌。遗传进化分析表明,本次分离的8株产气荚膜梭菌之间拥有共同起源,但与所用的参考菌株分属不同来源。多重PCR扩增结果显示,8株菌株均为产气荚膜梭菌A型。     

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病（A型）三联灭活苗

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病是危害家兔的三种重大传染病，目前对于这三种病的预防主要依靠疫苗免疫，但这些疫苗多为单茁，使用肘不但费时费力，还容易造成应激。     

1株阿尔巴斯绒山羊源产气荚膜梭菌的毒素型鉴定和16S rRNA基因的遗传进化分析

为了了解1例经诊断为产气荚膜梭菌病而死亡的阿尔巴斯种绒山羊感染的产气荚膜梭菌的毒素型和16S rRNA基因的遗传进化特性,试验设计5对特异性毒素引物,采用PCR方法进行毒素型的鉴定,对16S rRNA基因扩增和测序,对测序结果进行遗传进化分析。结果表明：只有α毒素引物扩增出约475 bp长的目的条带,阿尔巴斯绒山羊梭菌性肠炎的致病菌毒素为α毒素,为A型产气荚膜梭菌,其16S rRNA基因序列与天津地区产气荚膜梭菌(登录号为KP944160.1)位于同一分支,亲缘关系最近,核苷酸相似性为98.53%。说明此次阿尔巴斯绒山羊感染的产气荚膜梭菌的毒素型是A型,且鉴定菌株与天津地区产气荚膜梭菌(登录号为KP944160.1)起源于共同的祖先。