正交设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以辣椒基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP反应体系中的5种关键因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA)进行优化,结果表明,辣椒SRAP-PCR最佳反应体系为:Taq DNA 聚合酶0.75 U、Mg2+ 0.6 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.8 μmol/L、模板DNA 50 ng,总体积为10 μL.运用该体系对辣椒3份种质材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从198个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的35个引物组合.该体系的建立与多态性引物组合的筛选为SRAP标记技术在辣椒分子遗传学中的应用提供科学依据.     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化（摘要）

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（45）对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素（Taq聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系影响的大小顺序为：Mg2＋〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为：在20μl反应体系中,包括10×PCR buffer2.0μl、Mg2＋2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs0.2mmol/L、模板DNA40ng、引物0.6μmol/L。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

牡丹SRAP反应体系的建立及正交设计优化

采用L16(45)正交试验设计,对牡丹SRAP(sequence related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)反应体系中的Mg2+浓度、Taq聚合酶、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度5因素4水平正交优化,建立了适合于牡丹基因组的SRAP-PCR优化扩增反应体系,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs为0.3 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物为0.4μmol/L,模板DNA 1.0 ng/μL,总体积20.0μL。     

苦瓜SRAP反应体系的建立与优化

[目的]分子标记技术的快速发展为在DNA水平上估计苦瓜种质的遗传差异提供了更准确、更高效的方法。[方法]采用正交试验设计,对影响苦瓜SRAP反应体系的5种因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶及模板DNA)4个水平进行优化筛选。[结果]确立了适合苦瓜SRAP分析的优化反应体系,即1×buffer,1.0 ng/μl模板DNA,1.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,0.075 U/μlTaq聚合酶,总体积20μl。[结论]优化的SRAP-PCR反应体系的建立为利用SRAP技术进行苦瓜种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

二次通用旋转组合设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系

采用二次通用旋转组合设计,对辣椒SRAP反应体系中的Taq酶用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA用量等5个主要因素进行优化。结果表明,筛选出的辣椒最优SRAP-PCR反应体系为Taq聚合酶0.5 U,Mg2+2.3 mmol.L-1,dNTPs 0.2 mmol.L-1,引物0.8μmol.L-1,模板DNA 45 ng,总体积10μL。应用该体系对辣椒18份种质材料进行验证,结果证明该体系可靠稳定。因此,该试验的优化方法和优化体系适用于辣椒SRAP分子标记的研究。     

麻疯树SRAP-PCR反应体系的优化

采用L9(45)正交设计对影响麻疯树SRAP反应的5个因子(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶)在4个水平上进行优化试验,PCR结果采用SPSS13.0进行分析。结果表明,各因素对SRAP反应的影响依次为:Mg2+dNTPs引物Taq酶DNA模板。对SRAP反应结果影响较大的3个因子(Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度)进行单因素试验,确立麻疯树SRAP反应最佳体系为:20μL的PCR体系中含有Mg2+2.5 mmol/L、引物0.4μmol/L、dNTPs150μmol/L、DNA模板60 ng、Taq酶0.5 U。将该体系用于麻疯树的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。     

带叶兜兰SRAP反应体系的建立与优化(英文)

[目的]确定带叶兜兰的SRAP反应体系。[方法]以带叶兜兰嫩叶提取的DNA为材料,对带叶兜兰SRAP反应体系中的主要成分dNTPs、Mg2+、Taq酶、模板DNA及引物进行了单因子优化。[结果]最终确定了适合带叶兜兰基因扩增的SRAP反应体系:在25μl反应体系中加入10×PCR Buffer 2.5μl、dNTPs0.15 mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、引物0.4 mmol/L、Taq酶0.3 U。[结论]该体系扩增条带清晰,重复性好,可应用于带叶兜兰的多方面的分析。     

皱纹盘鲍SRAP反应体系的正交优化

采用L16(45)正交试验设计方法,对影响皱纹盘鲍Haliotis discus hannai SRAP反应体系的Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA以及Taq酶活性进行了优化,建立了适用于皱纹盘鲍的SRAP反应体系。优化后的反应体系(10μL)包括Mg2+1.5 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,引物0.2μmol/L,Taq酶活性0.25 U,模板DNA 20 ng。采用不同模板和引物对体系进行验证,表明优化后的反应体系能够高效地扩增出可识别条带,为进一步应用SRAP标记对皱纹盘鲍进行遗传分析奠定了基础。     

濒危植物蒙古扁桃SRAP反应体系优化

为利用SRAP技术研究蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定,利用正交试验法L_(16)(4~5)正交设计,对影响蒙古扁桃SRAP-PCR反应体系的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度4个因素以及模板DNA浓度进行筛选。优化的蒙古扁桃SRAP-PCR最佳反应体系为Mg~(2+)浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.25 mmol/L,模板DNA浓度为100 ng,Taq酶浓度为2.00 U,引物浓度1.0μmol/L,2.5μL 10×PCR buffer,总体积为25μL。筛选结果表明,对蒙古扁桃SRAP-PCR扩增结果影响最大的是Taq聚合酶浓度,最小的是dNTPs浓度。运用该体系对144个随机SRAP引物组合进行筛选,筛选出12个条带清晰、多态性高的引物组合,为蒙古扁桃种质资源的研究奠定了基础。     

华山松SRAP-PCR反应体系的优化

为建立华山松SRAP-PCR反应体系,研究先采用L16(45)正交设计对影响华山松SRAP反应的5个因子(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶)在4个水平上进行优化试验。结果表明:各因素对SRAP反应的影响依次为:Mg2+>dNTPs>Taq酶>DNA模板>引物;对SRAP反应结果影响较大的3个因子(Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度)进行单因素试验;确立华山松SRAP反应最佳体系为:20μL的PCR体系中含有Mg2+2.2mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、DNA模板60ng、Taq酶0.8mol/s、引物0.8μmol/L。将该体系用于华山松的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。     

"循化红"线辣椒SRAP-PCR反应体系的优化与建立

[目的]建立适合于“循化红”线辣椒基因组的SRAP-PCR优化扩增反应体系。[方法]采用L16（4^5）正交试验设计,对“循化红”线辣椒SRAP反应体系中的Mg^2＋浓度、Taq聚合酶、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行5因素4水平正交优化。[结果]“循化红”线辣椒的最佳SRAP—PCR反应体系为：Mg^2＋浓度为2．0mmol／L,dNTPs为0．5mmol／L,Taq酶0．5U,引物浓度为0．4μmol／L,模板DNA浓度为1．0ng/μl,总体积20μl。[结论]该体系的建立为SARP标记技术应用于“循化红”线辣椒种质资源的收集与利用,品种的鉴定、标记辅助育种等方面奠定了良好的试验基础。     

苦瓜抗白粉病SRAP标记筛选的PCR体系优化与验证

【目的】优化苦瓜抗白粉病SRAP标记的PCR体系,为获得苦瓜抗白粉病的SRAP分子标记、加快苦瓜抗白粉病新品种的选育提供参考。【方法】采用正交设计L16（45）,在已有SRAP-PCR扩增程序基础上,以苦瓜抗、感白粉病的父母本及其杂交后代基因组DNA为模板,用4对SRAP引物对模板DNA、dNTPs、Mg2＋、引物、TaqDNA聚合酶等5个因素浓度进行优化组合和验证。【结果】提取的苦瓜基因组DNA纯度较好,无蛋白质、RNA等物质污染,其纯度和完整性较好。利用引物对ME9-EM11进行PCR扩增,16个不同因素组合处理在苦瓜父本MC18和母本MC1-2的基因组DNA间的扩增结果有明显差异,其中以处理3的SRAP-PCR体系（20.0μL：DNA5.0ng/μL、dNTP0.05mmol/L、Mg2＋2.5mmol/L、引物0.6μmol/L、TaqDNA聚合酶0.088U/μL）获得较清晰、较多的扩增条带。用4对引物对验证优化的SRAP-PCR体系,其重复性好,不同苦瓜材料间无明显的多态性。【结论】优化的SRAP-PCR体系适用于苦瓜抗白粉病SRAP分子标记的筛选。     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（4^5）对小麦SRAP．PCR反应体系中的5因素（细聚合酶、Mg^2、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系的影响为：Mg^2〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP—PCR体系为：在20山反应体系中,包括10×PCRBuffer2．0山、Mg^2 2．0mmol／L、砌聚合酶2．0U、dNTPs0．2mmol／L、模板DNA40ng、引物0．6μmolVL。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

SRAP分子标记用于苦荞分析中的条件优化

[目的]研究SRAP分子标记用于苦荞分析中的条件优化。[方法]采用交互正交设计L27（313）对苦荞SRAP-PCR反应体系进行了5因素（Mg2＋、dNTP、Taq酶、模板DNA和引物）3水平优化筛选,比较了非变性和变性PAGE检测方法,并进行了DYCZ-24F与DYCZ-20C2种电泳操作系统的对比试验。[结果]4个单因素（Mg2＋、dNTP、Taq酶和引物）和2个交互作用（Mg2＋×dNTP、Mg2＋×Taq酶）对苦荞SRAP-PCR有极显著影响;最佳反应体系为：20μl总体积,Mg2＋1.5mmol/L,dNTP0.2mmol/L,Taq酶1.5U,模板DNA40ng,引物0.25μmol/L,10×缓冲液2μl。运用该体系对7份苦荞材料进行扩增,电泳结果显示扩增条带清晰、多态性高、重复性好。将扩增产物进行非变性与变性PAGE和2种电泳操作系统检测,结果显示,非变性PAGE、DYCZ-24F操作系统更适合于SRAP的分析。[结论]该研究为今后构建苦荞SRAP遗传图谱奠定了基础。     

Establishment and Optimization of SRAP Amplification System in Lonicara caerulea L.

A single factor design was applied to optimize five factors influencing SRAP system, including Taq DNA polymerase, template DNA concentration, dNTPs, primer and Mg2＋, each at four levels. The optimal SRAP-PCR system for Lonicera caerulea L. was 20 ktL SRAP-PCR amplification reaction solution containing 2.0 μL 10×PCR buffer, 1.0 U Taq DNA polymerase, 30 ng template DNA, 0.2 mmol·L-1 dNTPs, 2.0 mmol·L-1 Mg2＋ and 0.2μmol·L-1 primer. The suitable amplification procedure consisted of an initial denaturation at 94℃ for 5 min; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 35℃ for 1 rain, extension at 72℃ for 90 s and in total five cycles; denaturation at 94℃ for 1 min, annealing at 50℃ for 1 min, extension at 72℃ for 90 s and in total 35 cycles; extension at 72℃ for 8 rain; preservation at 4℃. The procedures and systems could meet the demand for SRAP amplification of Lonicera caerulea L. and would play an important role in Lonicera caerulea L. germplasm identification and genetic diversity analysis.     

蝴蝶兰SRAP反应体系的建立与优化

以蝴蝶兰嫩叶提取的DNA为材料,蝴蝶兰SRAP反应体系中的重要参数Mg2＋、Taq酶、模板DNA及随机引物,建立了一套适合蝴蝶兰基因扩增的SRAP反应体系：25μL的反应体系中Mg2＋浓度为2.0mmol/L,Taq酶1.0U,DNA模板40ng,上下游引物0.8mmol/L。该体系扩增条带清晰,重复性好,有望在蝴蝶兰属植物的遗传育种研究中运用。