基于晚疫病菌效应子识别策略挖掘马铃薯潜在抗病基因资源

为探索利用晚疫病菌效应子识别策略快速挖掘具有潜在抗晚疫病基因的马铃薯资源,挑选了晚疫病菌侵染马铃薯时早期上调表达的68个RXLR类效应子基因,将它们分别克隆到PVX病毒植物表达载体pGR106上,采用农杆菌牙签穿刺方法,在55份不同基因型的马铃薯叶片上进行瞬时表达,根据过敏反应（Hypersensitive response,HR）发生与否来推断马铃薯中是否存在潜在抗病基因。结果表明,10个效应子基因,包括无毒基因AVR2家族成员PITG_23008,细胞死亡激发子PexRD2、无毒基因PexRD39（AVRblb2）,以及其它未知功能效应子基因Pex147-2、PexRD8、PexRD49、PITG_10232、PITG_11484、PITG_07555和PITG_22724,能够在10份马铃薯材料上诱导HR,预示这些马铃薯材料中具有潜在抗病基因。另外,离体叶片晚疫病菌接种鉴定表明,识别6个晚疫病菌效应子的马铃薯材料IVP196-2比识别3个效应子的马铃薯材料HJT349-3抗病性更强。     

马铃薯转萝卜抗菌肽基因植株的获得及其抗晚疫病的初步鉴定

为获得抗晚疫病的转基因马铃薯植株,采用根癌农杆菌介导法,以微型薯薯片为外植体,将萝卜抗菌肽基因（AFP）导入马铃薯栽培品种夏波蒂（Shepody）中,通过草甘膦抗性筛选和PCR检测获得了4株转基因试管苗,并经黑暗诱导获得了微型薯。采用离体叶片接种法,对微型薯长出的叶片进行抗晚疫病鉴定,结果表明这4个株系的抗病性均有一定程度的提高。     

高温胁迫下番茄叶片差异表达基因的cDNA-AFLP鉴定

 为鉴定番茄高温胁迫响应基因,应用cDNA-AFLP技术,以番茄耐热品系Saladette幼苗为研究对象,对高温胁迫早期叶片基因表达进行了mRNA指纹分析。通过768对引物组合的筛选,共分离得到187个差异表达的转录衍生片段(TDF),其中增强表达或高温胁迫下特异性表达TDF153条,抑制表达34条。对其中47个TDF进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：34个TDF与NCBI或TIGR已有序列同源（E-Value<10^-5）,功能涉及信号传导、转录调控以及逆境诱导蛋白等,另有13个TDF无同源序列或同源性低,预测是一些未知功能基因。     

马铃薯广谱抗病Rpi-blb1 同源基因抗性被进化晚疫病菌株克服

 马铃薯晚疫病广谱抗性基因Rpi-blb1（克隆于Solanum bulbocastanum）及其两个同源抗病基因Rpi-sto1（克隆于Solanum stoloniferum）和Rpi-pta1（克隆于Solanum papita）的抗性可能已被高度进化的晚疫病菌株所克服。为证实此观点,将从荷兰田间和墨西哥野外S. bulbocastanum 和S. stoloniferum 病株上采集的晚疫病菌株重新接种于具有共同遗传背景（感病栽培品种Desiree）的Rpi-blb1 及其同源基因转化体和3个野生种植株上,测试Rpi-blb1 及其同源基因的抗性是否已被克服。结果表明,采自墨西哥野外S. stoloniferum的两个菌株Pic99189 和Pic99192 已经克服了Rpi-blb1 及其同源基因的抗性;在野生种植株的测试中,只有S. papita 的抗性明显地被菌株Pic99192 所克服。同时发现在转基因植株离体叶片接种试验中,高抗晚疫病菌的转化体需要在多个转化体间进行选择。从采自中国4 个不同地区晚疫病菌株接种sto1.Desiree 转化体的小规模测试中可推断,Rpi-blb1 及其同源抗性基因在中国仍具有潜在的应用价值。     

马铃薯广谱抗病Rpi-blb1同源基因抗性被进化晚疫病菌株克服

马铃薯晚疫病广谱抗性基因Rpi-blb1(克隆于Solanum bulbocastanum)及其两个同源抗病基因Rpi-sto1(克隆于Solanum stoloniferum)和Rpi-pta1(克隆于Solanum papita)的抗性可能已被高度进化的晚疫病菌株所克服。为证实此观点,将从荷兰田间和墨西哥野外S.bulbocastanum和S.stoloniferum病株上采集的晚疫病菌株重新接种于具有共同遗传背景(感病栽培品种Desiree)的Rpi-blb1及其同源基因转化体和3个野生种植株上,测试Rpi-blb1及其同源基因的抗性是否已被克服。结果表明,采自墨西哥野外S.stoloniferum的两个菌株Pic99189和Pic99192已经克服了Rpi-blb1及其同源基因的抗性;在野生种植株的测试中,只有S.papita的抗性明显地被菌株Pic99192所克服。同时发现在转基因植株离体叶片接种试验中,高抗晚疫病菌的转化体需要在多个转化体间进行选择。从采自中国4个不同地区晚疫病菌株接种sto1.Desiree转化体的小规模测试中可推断,Rpi-blb1及其同源抗性基因在中国仍具有潜在的应用价值。     

黑龙江省马铃薯晚疫病菌与采集年份和地理来源相关性分析

以2005、2006、2008年采集于黑龙江省哈尔滨市的17份马铃薯晚疫病菌株和2006年采集于黑龙江省8个地点的46份菌株(均为A1交配型)为试验材料,利用21对EST-SSR引物,分别对菌株与采集年份以及菌株与地理来源的相关性进行了聚类分析。结果表明:在相同地点采集的晚疫病菌株与采集年份之间具有一定的相关性;在相同年份采集的晚疫病菌株与地理来源之间也具有一定的相关性。     

利用cDNA-AFLP研究辣椒细胞核雄性不育差异表达基因

辣椒细胞核雄性不育两用系在辣椒杂交种配制方面有着非常重要的应用,为了进一步了解其不育性的分子机理,利用cDNA-AFLP对辣椒细胞核雄性不育两用系‘AB23’可育株和不育株花蕾的mRNA指纹图谱进行了初步分析。结果表明:共获得19个差异表达的TDF,均来自可育株。在可育株花蕾中得到了19个TDFs,其中13个TDFs功能已知,2个功能未知,4个没有找到同源序列。对13个已知序列的分析表明,这些基因涉及了细胞的代谢、转录、胞间运输和信号转导等相关过程。通过半定量RT-PCR技术对获得的19个TDFs进行验证,其表达特征与cDNA-AFLP结果一致。     

马铃薯抗晚疫病主效基因R10的RGA-CAPS标记的开发

马铃薯晚疫病抗性基因R10,属于马铃薯抗晚疫病主效位点MLB单倍型之一,该位点已知的各单倍型基因均具有保守结构域,属于同一个R3a基因家族。将R3a基因和源于MLB位点的R3a基因的同源序列进行比对,根据它们高度保守的区域设计引物,以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10（含抗晚疫病基因R10）、四倍体马铃薯栽培种Katahdin（不含已知抗病基因）及其杂交一代为试材,得到R3a的抗病基因同源序列,再结合限制性内切酶筛选,开发出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记：RGA-600和RGA-1000,这两个标记距离R10基因0.25cM。     

接头连接介导的PCR 扩增马铃薯抗晚疫病基因侧翼序列研究

利用接头连接介导的PCR 技术,以前期NBS profiling 试验获得的1 条马铃薯抗晚疫病基因
片段为基础,设计巢式基因特异性引物,扩增获得两侧序列。结果表明：基因组DNA 经DraⅠ酶切后,
在已有536 bp 片段的左侧和右侧均得到序列延伸,右侧扩增得到2 301 bp,左侧扩增得到820 bp,去除
边界序列后,向左延伸789 bp,向右延伸2 273 bp,拼接后共长3 443 bp。采用GENSCAN 进行基因预测,
发现包含内含子在内的晚疫病抗性基因全长2 413 bp,在该预测基因 的UTR 区域设计特异性引物,在马
铃薯抗病和感病的基因型中扩增包含完整基因在内的2 571 bp 序列,发现该特异候选基因与晚疫病抗性相
连锁。     

应用cDNA-AFLP技术分离草菇冷诱导表达基因

 采用cDNA-AFLP技术筛选获得了5个草菇冷诱导表达基因片段VC1、VC2、VC3、VC4 和VC5。测序结果表明, 5个DNA片段大小分别为247 bp、219 bp、172 bp、350 bp和171 bp。同源性BLAST搜索结果显示, VC1、VC2、VC3、VC4和VC5片段目前都没有同源的核酸序列; VC1片段翻译的蛋白质序列与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) 的假拟蛋白具有一定的同源性, VC2片段翻译的蛋白质序列与水稻的AMP脱氨酶具有一定的同源性, VC3片段翻译的蛋白质序列与Danio rerio的糖原合酶激酶3α具有较高的同源性, VC4片段翻译的蛋白质序列与Leuconostocm esenteroides的假拟蛋白有一定的同源性, VC5片段翻译的蛋白质序列没有搜索到同源序列。     

利用cDNA．AFLP技术鉴定甘蓝显性核不育基因相关表达序列

 利用cDNA—AFLP技术， 比较分析了一个甘蓝与两个青花菜自交系回交转育的显性核基因雄性不育材料与对应可育亲本植株花蕾发育过程中基因表达的差异。将花蕾混合提取RNA合成eDNA建立6个eDNA池，分析128个弓l物组合获得了26000个片段，共鉴定24个片段与雄性不育相关，其中13条表现为质的差异，11条表现为量的差异；将其中引物组合A16T15产生的300 bp左右的差异片段进行克隆测序，BLAST结果表明，该序列与花粉特异性相关的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性达89％ 。     

半矮生型桃节间长度相关基因的筛选和鉴定

 为了进一步研究调控节间长度相关基因的表达模式及为克隆该半矮生性状的基因提供依据, 采用cDNA-AFLP 分析方法对半矮生型桃节间“生长跃变期”差异表达的基因进行筛选,并对差异的转录 衍生片段（TDFs）进行回收、克隆、测序、功能注释及qRT-PCR 验证。采用256 对引物,共产生9 021 个TDFs,有明显差异的TDFs 共899 个,成功回收到497 个TDFs,254 条序列与已知基因高度相似。差 异表达的基因主要涉及到信号转导、生长发育、转录调控、蛋白质代谢、防御和物质与能量代谢等。选 取其中26 个基因进行实时荧光定量PCR 验证,结果表明26 个基因的qRT-PCR 表达丰度分析与 cDNA-AFLP 结果一致。分离到植物生长素、细胞分裂素、油菜素内酯、脱落酸、细胞周期等调控途径中 生长调控相关的候选基因,可为阐明节间生长调控机制奠定基础。