巴西橡胶树排胶机制研究进展

橡胶树是世界上商业用天然橡胶最主要的来源,排胶是天然橡胶生产的最后关键环节,为了安全高效的获取胶乳产量,橡胶树排胶机制的研究一直受到人们的重视。橡胶树中的乳管是天然橡胶合成和储存的组织,人们通过割胶收集从乳管中流出的胶乳用作提炼天然橡胶。胶乳的排出速度及排胶持续时间是决定天然橡胶产量的重要因素,是排胶动力和排胶阻力共同作用的结果。笔者对与排胶相关的乳管细胞学基础、排胶主要初动力的乳管膨压、排胶继动力的乳管胶乳水分稀释效应以及乳管排胶阻力的形成及其调控机制等研究进行了归纳,主要分析了乳管伤口堵塞物的形成和影响排胶阻力的多种因素,指出乳管堵塞在胶乳的停排中起重要作用。针对目前排胶机制的研究进展缓慢这一现状,我们提出有必要从以下几点展开深入研究：（1）乳管膨压形成相关的树皮木质素合成和调控;（2）水分运输相关的水通道蛋白基因表达和活性分析;（3）停排相关的乳管伤口末端堵塞物的形成和调节。这些研究将为全面解析橡胶树排胶机制奠定基础,也可为分子辅助育种-选育排胶通畅的种质提供依据。     

巴西橡胶树HbMago3的克隆和表达分析

为了在基因组水平鉴定和分析巴西橡胶树中Mago基因家族的数量、结构和功能,本研究对巴西橡胶树Mago基因家族的数量、基因结构、染色体分布和蛋白特性进行了系统鉴定和分析;进一步克隆鉴定新的Mago基因,分析其组织表达水平和对激素(茉莉酸和乙烯)的响应。本研究从reyan7-33-97中鉴定了4个Mago基因,分别命名为HbMago1、HbMago2、HbMago3和HbMago4。HbMago2和HbMago3的可变剪切事件发生在第二个外显子,CDS存在66个碱基的差异,导致蛋白短了22个氨基酸、等电点低0.35;HbMago4可变剪切事件发生在5端的非翻译区,CDS和蛋白序列无差异。4个基因序列均包含3个外显子,HbMago1、HbMago2和HbMago4含有2个内含子,HbMago3含有3个外显子。4个基因序列分布在两条scaffold(NW-018745965.1和NW-018746420.1)上的4个位点。进化分析结果表明4个基因聚类在同一个进化枝条上,为单进化起源;橡胶树在进化过程中获得3个Mago基因而丢失1个基因。克隆了HbMago3,半定量结果表明HbMago3在根、胚...     

巴西橡胶树HbbHLH1启动子的克隆与序列分析

bHLH转录因子在高等植物生长发育、激素应答和次生代谢调节中具有重要的功能.根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HbbHLH1基因设计了2个特异性反向引物,利用GenomeWalking方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbbHLH1基因起始密码子上游819 bp的调控片段.序列分析表明,该片段除了含有一个典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与激素和胁迫诱导相关的顺式调控元件,其中在-290 bp和-309 bp位点分别有一个应答MeJA信号反应的调控元件,但没有发现典型的乙烯响应元件.这暗示了HbbHLH1转录因子可能在橡胶树乳管分化和胶乳生物合成中具有调控作用.     

巴西橡胶树HbTCTP基因的克隆及表达

在先前的研究中通过抑制缩减杂交获得了一个在巴西橡胶幼态无性系与老态无性系胶乳中差异表达的片段(HbSSHl2),BlastX分析表明,由该片段编码的氨基酸与麻疯树(Jatropha curcas L.)翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)的同源性达到92%.本研究根据HbSSHl2的序列信息设计引物,通过3L-RACE的方法获得了一个长832bp的cDNA(命名为HbTCVP),序列分析表明HbTCTP有507 bp的阅读框,68 bp的5'-UTR和255 bp的3'UTR,编码168个氨基酸,该氨基酸序列与麻疯树、油棕、花生、南瓜、番茄和拟南芥的TCTP同源性分别达到93.45%、90.48%、89.29%、85.12%、82.74%和79.76%.RT-PCR表明,HbTCTP在巴两橡胶叶片、胶乳及树皮中都有表达,乙烯利处理可诱导HbTCTP的表达,割胶抑制HbTCTP的表达,表明HbTCTP可能参与伤信号或乙烯信号传导.HbTCTP的表达分析有助于解析橡胶树幼态无性系高产的分子机制.     

巴西橡胶树DUS测试指南研制初探

为加强橡胶树新品种保护工作,在国际新品种保护联盟（UPOV）对DUS测试的基本要求和品种的生物学特性的基础上,制定巴西橡胶树DUS测试指南,阐述了其研制过程,品种测试的特殊性,性状的筛选原则和发展方向等。建议橡胶树DUS测试标准不宜定太高,测试性状要能体现中国育种水平和方向,并遵循UPOV原则。并认为分子标记技术与表型测试技术相结合将逐步成为橡胶树DUS测试的主要手段。     

巴西橡胶树DNA甲基化的MSAP分析

本文采用"甲基化敏感扩增多态性"(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism,MSAP)的分析方法,在全基因组水平检测巴西橡胶树DNA甲基化位点,确定巴西橡胶树基因组DNA甲基化模式和水平。结果表明:16对MSAP引物选择性扩增,共扩增262条带,其中甲基化位点87个,甲基化比例为33.21%,其中,半甲基化位点为32个,比例为12.22%;全甲基化位点为55个,比例为20.99%。对部分巴西橡胶树基因组甲基化位点进行回收,最终分离了18条存在甲基化的基因组DNA序列。BLAST比对后,同源分析表明巴西橡胶树基因组中包括转录因子、蛋白激酶等在内的多种类型的DNA序列中均存在甲基化现象。本研究为深入研究巴西橡胶树的DNA甲基化奠定基础。     

巴西橡胶树HbDBB家族基因的鉴定与表达分析

本研究从橡胶树基因组中鉴定到9个HbDBB家族基因,并对这些基因的基因结构、启动子调控元件、染色体定位、进化和表达进行分析。结果显示,HbDBB家族成员分布在七条染色体和一个Contig上,编码蛋白的氨基酸数目为171～453个,分子量在18.20～50.13 kD,启动子区域含有多种植物激素和环境胁迫应答相关作用元件。系统进化分析表明DBB可以分成4个亚组,亚组成员在基因结构、保守基序数目和相对位置等方面具有较高相似性。表达分析显示HbDBB具有组织表达特异性,胶乳中HbDBB4和HbDBB6表达水平最高,叶片中HbDBB3和HbDBB4的表达水平最高。增产处理实验表明,HbDBB2、HbDBB4和HbDBB6受乙烯诱导,Hb DBB6受割胶诱导但不明显。叶片发育过程中,HbDBB3、HbDBB4和HbDBB9随着发育进程表达上调。本研究初步揭示了橡胶树DBB家族成员的理化特征和表达特性,为进一步研究该基因在橡胶树中的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树单个花粉细胞显微分离

巴西橡胶树是一种重要的热带产胶作物。因巴西橡胶树基因高度杂合,容易受到遗传或环境影响,为了不受群体效应的干扰,以巴西橡胶树‘热研7-33-97’的幼嫩雄花为试验材料,利用显微分离技术获取单个花粉细胞,使用5%纤维素酶+4%果胶酶混合酶和8%纤维素酶+6%果胶酶+3%蜗牛酶混合酶在不同条件(温度,时间)下,探索花粉细胞壁的最佳酶解体系。结果表明：8%纤维素酶、6%果胶酶和3%蜗牛酶混合酶在42℃条件下水浴15 h酶解效果最佳;同时利用随机引物(S2147和S1402)对酶解后的单个细胞进行酶解去壁效果的RAPD-PCR扩增鉴定,结果揭示该酶解体系能对花粉细胞进行去壁,使核酸物质得以释放并扩增。本试验以单个花粉细胞为研究对象,进行花粉细胞的显微分离,酶解去壁及RAPD-PCR扩增鉴定,为后续进一步开展‘热研7-33-97’单细胞全基因组测序、构建遗传图谱及橡胶树分子辅助育种等提供了科学依据。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆及表达分析

为了进一步研究橡胶生物合成的分子机制,根据巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）cDNA文库中的EST序列,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离了一个巴西橡胶树钙调蛋白基因,命名为HbCAM1。分析结果显示,该基因cDNA全长775 bp,含有完整的阅读框架,编码区为450 bp,编码149个氨基酸,5’非编码区26 bp,3’非编码区299 bp。通过序列比对以及结构预测分析,HbCAM1编码的氨基酸序列与蓖麻、毛葡萄、烟草、麻风树中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到100%、100%、99%、99%。半定量RT-PCR分析显示,HbCAM1基因可能通过对相关代谢基因表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控。     

巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳cDNA文库的构建

摘要：以巴西橡胶树热研7-33-97为材料,对橡胶树割线下方施用0.1%茉莉酸,采集胶乳,提取胶乳总RNA并纯化mRNA,构建巴西橡胶树茉莉酸诱导胶乳融合表达文库。检测表明,获得的初级文库滴度为1.9×106 pfu/ml,插入片段在0.5到5kb之间,平均大小为1kb左右;表明该文库质量合格,为今后克隆胶乳中的茉莉酸信号应答基因奠定基础。     

巴西橡胶树自根幼态无性系的试管微繁

带有腋芽的橡胶花药苗切段接种在MS 6—BA2mg/L的培养基上,30～40天新芽可长至3～5cm高,并可切割再次增殖;切取3～5cm高带叶片的增殖芽作为插条,基部经50～100mg/L IBA预处理再插到生根培养基上,生根率达95％;诱发的根系与茎杆之间愈合良好,输导组织连接紧密,生根植株移栽成活率达85％以上。     

巴西橡胶树SSR反应体系的优化

摘 要： 以巴西橡胶树无性系针选2号为试验材料,对橡胶树SSR-PCR反应的5个主要因素：TaqDNA聚合酶、Mg2+、引物、DNA模板及dNTPs进行优化试验。筛选出了各反应因素的最佳水平,建立了橡胶树SSR-PCR最佳反应体系（20ul）: TaqDNA聚合酶0.8U;Mg2+ 浓度1.5mmol•L-1;引物浓度0.5μmol•L-1;模板DNA 含量50ng; dNTPs浓度 0.25 mmol•L-1。并利用此反应体系,用引物1对14个巴西橡胶树品种进行SSR分析,8%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测显示不同品种间DNA谱带多态性丰富,结果证明,此反应体系是稳定可靠的,这为下一步进行的遗传多样性分析、指纹图谱构建等研究奠定基础     

橡胶树Ago蛋白基因家族分析

Ago蛋白基因家族成员与不同的小RNA结合,广泛参与细胞的生长发育及抵抗外源DNA的入侵。对Ago蛋白基因家族成员的研究有利于进一步了解各成员的功能,同时有助研究小RNA的功能。橡胶树的Ago蛋白基因家族及小RNA的研究均较少,为了弄清楚橡胶树Ago蛋白基因家族成员情况及其初步功能,本研究对橡胶树(Hevea brasiliensis)所有蛋白质序列进行了分析。用HMMER及BLAST等软件分析发现橡胶树有18个Ago蛋白,这些Ago蛋白进行分类及理化性质分析,发现其可分为3类,大多数Ago蛋白定位于细胞核,蛋白序列长度在577 aa至1 237 aa氨基酸之间,等电点在8.66至9.47间。通过qPCR技术研究橡胶树Ago蛋白的表达,发现18个Ago蛋白在不同叶龄间有差异,在白粉病菌对橡胶树进行感染处理后各Ago蛋白的表达也有差异,说明不同的Ago蛋白参与了不同的生理过程。这些结果为进一步研究各Ago蛋白在橡胶树的生长发育及抗病抗逆过程中的功能提供了理论依据。     

持续干旱胁迫及复水对橡胶树渗透调节能力的影响

干旱胁迫是影响植物生长发育的重要因子。为了研究橡胶树的抗旱能力及其抗旱机制,以橡胶树为供试材料,通过盆栽试验,在温室条件下研究自然干旱胁迫和复水处理对橡胶树叶片渗透调节物质及细胞膜透性的影响。结果表明：随着干旱胁迫时间的延长,相对电导率、游离脯氨酸含量、可溶性糖含量及可溶性蛋白含量都呈现上升的趋势;复水处理后,相对电导率与可溶性蛋白含量均能恢复至对照水平;游离脯氨酸含量与可溶性糖含量呈下降趋势,但高于对照水平。综合各指标变化情况,说明橡胶树有着较强的抗旱和恢复能力。     

同位素示踪技术研究JA在巴西橡胶树中的运输和分布

为了研究外源茉莉酸(jasmonic acid,JA)在巴西橡胶树中的移动方向、运输途径以及分布规律,以无性系CATAS7-33-97为实验材料,对其幼嫩萌条进行外施3H-JA和3H-JA+机械伤害处理,用同位素示踪技术对外源3H-JA在萌条不同部位的放射性强度进行了研究。结果表明,外施JA在进入植株体内1 h后,大部分集中在施用部位;伤害能明显阻止外源JA进入树皮组织,但同时也阻止进入了的JA再向其他部位转移;新梢中积累的JA明显低于施用部位,但比其他4个部位都高。外源JA在巴西橡胶树中可以同时向上和向下运输,运输的途径主要是韧皮部,但木质部也是运输部位之一。由此可见,在巴西橡胶树中,外源JA能够迅速地被运输到周边部位,代谢旺盛的部位具有易富集JA的能力,而机械伤害对JA在植株体内的分布有明显的影响。