番木瓜eIF4E突变基因的构建

真核翻译起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor4E,eIF4E）的缺失或突变能影响病毒对植物的侵染,并介导植物对病毒产生抗性。已有研究证明,番木瓜环班病毒的VPg能与番木瓜elF4E（Cp－eIF4E）互作,在此基础上,笔者通过蛋白序列比对和同源建模分析,确定了6个突变位点,采用套叠PCR方法印Cp－eIF4E基因进行点突变,然后,将它们分别连接到酵母双杂交系统和双分子荧光互补系统两套表达载体上,为后续互作实验和抗病功能验证奠定基础。     

巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体△CCK1的互补载体构建及转化

为了明确蛋白激酶CCK1在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能,在前期研究基础上通过PCR扩增,获得了该基因1604 bp的5′端片段（L－C5）和131 bp的3′端片段（L－C3）,同时以pCAMBIA3300质粒为模板扩增获得了552 bp抗性标记基因（L－Bar）,并用In－FusionHD Cloning Kit将L－Bar基因反向插入了L－C5和L－C3序列之间,克隆至pUC19载体上,成功构建了△CCK1突变体的互补载体p△CCK1－C。再从该载体上扩增互补片段,借助PEG介导法转化△CCK1突变体的原生质体,经Basta平板筛选、PCR检测和测序鉴定表明,获得了△CCK1突变体的互补转化子。为进一步明确CCK1基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能打下了材料基础。     

以G418为筛选标记的籼稻二次遗传转化方法建立

为了研究籼稻有效的农杆菌介导二次遗传转化方法,以T-DNA插入突变体M1和M2幼胚为受体材料,通过G418浓度分别为100 mg/L和150 mg/L(20 d/代)的筛选培养基筛选获得的抗性胚性愈伤,转化率最高分别为10.91％和11.05％;分化生根获得M1和M2基因互补转基因水稻植株各143株和180株,经PCR检测阳性率分别达到72.0％和76.1％.试验结果表明,以G418为筛选标记的籼稻二次遗传转化方法,可以成为水稻遗传改良及基因功能研究的新方法.     

农杆菌介导法构建里氏木霉ura3基因突变体的研究

构建了ura3缺失基因载体pEMT-△ura3,采用农杆菌介导法转化里氏木霉QM9414,在含尿嘧啶核苷(1.87 mg.mL-1)和五氟乳氰酸(5-FOA,5 mg.mL-1)的筛选培养基上筛选转化子,经表型验证和PCR检测,获得ura3基因缺失突变体1株,ura3基因的同源重组率为16.6%。采用农杆菌介导法将黑曲霉的pyrA基因导入ura3基因缺失突变体中,使其回复野生型表型,从而建立了以pyrA基因作为筛选标记的里氏木霉受体菌株。     

理性设计和定点突变对提高海藻糖合酶TreSI热稳定性的影响

[目的]来源于黏细菌Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶(trehalose synthase, EC 5.4.99.16)TreSI可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖，在酶法生产海藻糖上有很高的应用前景，其热稳定性是制约该酶工业应用的关键。本文旨在通过定点突变对TreSI相关氨基酸残基进行改造，以期获得热稳定性强的突变子，提高其应用潜力。[方法]使用在线预测软件PoPMuSiC-2.1对TreSI每个氨基酸突变后的去折叠自由能变化(ΔΔG)进行初步预测，以SDM(site directed mutator)和mCSM(mutation cutoff scanning matrix)以及两者联合(Duet)进行预测。用重叠延伸PCR法构建11个海藻糖合酶突变体，经大肠杆菌表达和蛋白纯化后，对其酶学特性进行表征。[结果]成功筛选到2个热稳定性提高的突变子。突变子R149L、N193E的比酶活与野生型无显著差异，且最适pH值和最适反应温度也未发生改变；R149L、N193E在50℃处理1 h的残余酶活性为野生型的1.37和2.50倍；在60℃处理1 h的残余酶活性为野生型的2...     

玉米ZmCCT基因缺失区段原核表达载体的构建与蛋白表达

[目的]旨在纯化玉米ZmCCT基因缺失区段的原核表达蛋白.[方法]依据ZmCCT氨基酸序列中的CCT保守功能区,利用PCR技术获得ZmCCT基因的缺失突变体DNA片段,分别构建4个原核蛋白表达缺失区段.[结果]成功获得3个缺失区段的原核蛋白:ZmCCT1-300,ZmCCT300-540和ZmCCT1-540.[结论]该研究不仅有助于ZmCCT多克隆抗体的纯化,还将为探索ZmCCT的抗病分子机理奠定基础.     

敲除Ac148-150对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒复制和外源蛋白表达的影响

【目的】同时敲除苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组的Ac148、Ac149、Ac150(Ac148-150)基因,检测敲除Ac148-150基因片段对AcMNPV复制和外源蛋白表达能力的影响,为基因功能鉴定和缩小杆状病毒基因组提供参考。【方法】利用Red/ET同源重组系统和rpsL-AMP反向筛选系统对Ac148-150基因进行敲除,得到敲除型杆状病毒质粒(KOAc148-150杆状病毒质粒),提取AcMNPV KOAc148-150杆状病毒质粒和野生型杆状病毒质粒,将其分别与报告基因表达载体共转染Sf9细胞,成功构建重组杆状病毒(野生型病毒vAcMNPV/GFP和缺失突变病毒vAc△148-150/GFP),测定2种重组杆状病毒的一步生长曲线并比较其差异。将2种重组杆状病毒感染Sf9细胞后,采用荧光显微镜观察GFP荧光细胞分布,用流式细胞仪检测GFP荧光强度,再通过SDS-PAGE和Western blot检测Ac148-150缺失突变体表达的GFP产量。【结果】菌落PCR结果表明,AcMNPV中Ac148-150基因敲除成功。缺失突变病毒vAc△148-150/GFP与野生型病毒vAcMNPV/GFP的一步生长曲线基本一致,说明Ac148-150缺失不影响病毒的复制。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析结果表明,敲除Ac148-150对外源蛋白GFP分布和荧光强度未产生影响。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,缺失突变病毒vAc△148-150/GFP和野生型病毒vAcMNPV/GFP表达GFP蛋白产量基本一致。【结论】从AcMNPV基因组中同时敲除Ac148、Ac149、Ac150基因后,对病毒的复制和外源蛋白的表达能力无影响。     

利用电转化法构建烟草野火病菌的Tn 5插入突变体

采用电转化法将含有kanr基因标记的EZ::Tn 5转座子插入到烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci)的基因组中.结果表明,在电压为2 400 V条件下,供试的烟草野火病菌菌株SMX 006及WT 4的电转化效率分别为0.8×103,4.2×103 cfu·μg-1 DNA.转化电压下降至1 800 V时,WT 4菌株的转化效率也随之下降至1.64×103 cfu·μg-1 DNA.对转化子进行kanr筛选以及特异性PCR鉴定,表明Tn 5可以稳定地插入到受体菌的基因组中.对烟草野火病菌SMX 006的Tn 5插入突变体进行了多次致病性﹑运动性和胞外蛋白酶活性测定,从中获得了2个致病力明显减弱的突变株(H 028,H 029)、1个运动能力明显减弱的突变株(H 028)、1个运动能力丧失的突变株(H 029)、1个产胞外蛋白酶能力明显减弱的突变株(H 046),以及1个胞外蛋白酶缺失的突变株(H 045).     

人溶菌酶定点突变基因在毕赤酵母中的表达及活性分析

利用PCR法将人溶菌酶(h LYZ)成熟肽与载体信号肽连接处的氨基酸残基进行定点突变,突变基因亚克隆至酵母分泌型表达载体p PICZαA,重组载体线性化后通过电击转化法转化巴斯德毕赤酵母X-33,利用含Zeocine抗生素的YPDS平板筛选高拷贝转化子。转化子酵母经甲醇诱导后取培养基离心上清液进行SDS-PAGE和活性检测。结果显示,突变体h LYZ活力和表达量较野生型均有显著提高。表明定向改变h LYZ信号肽残基性质可以提高其表达量和分泌效率。     

烟碱型乙酰胆碱受体β4亚基点突变体的构建

利用PCR介导的定点突变技术构建包含β4亚基的烟碱型乙酰胆碱受体点突变体模型,同时采用双电极电压钳技术,对激动剂ACh和拮抗剂α-CTx RegIIA对突变受体的活性进行检测。结果表明:β4亚基胞外N端序列第168位的异亮氨酸(Ile)成功突变成了丝氨酸(Ser),突变后的受体对激动剂ACh的活性降低,对拮抗剂α-CTx RegIIA的活性降低了1.4倍,半阻断剂量(IC_(50))为170 nmol·L~(-1)。     

蚕豆耐盐相关基因VfHKT1;1的克隆、生物信息学分析及表达特性

高亲和性钾离子转运蛋白(high affinity K+transporter,HKT)能够调节细胞及整株的Na+/K+转运,在植物盐胁迫调控中发挥着重要作用.采用RT-PCR和PCR方法克隆获得蚕豆VfHKT1;1基因全长编码序列,该基因包含1659 bp的开放阅读框,编码552个氨基酸.系统进化树分析发现,该蛋白属...     

不同盐浓度对紫花野百合种子萌发特性的影响

以紫花野百合的蒴果为试验材料,模拟中性盐胁迫和碱性盐胁迫,对紫花野百合种子 在不同Na＋浓度下萌发情况进行研究,测定萌发过程中的萌发率、萌发势、萌发指数,分析不同 类型盐胁迫对种子萌发参数的影响。结果表明,中性盐胁迫下,Na＋浓度为30、50mmol.L-1 时, 促进种子的提前萌发,种子萌发率、萌发势、萌发指数提高;碱性盐胁迫下,随着Na＋浓度的升 高,萌发率、萌发势、萌发指数均呈现显著下降趋势,当中性盐和碱性盐Na＋浓度分别达到170、 130mmol.L-1 时,完全抑制种子的萌发。紫花野百合对中性盐的耐受水平比碱性盐高,盐胁迫下 表现出增效、负效和完全抑制三个方面的萌发特性。     

K~+,Ca~(2+)和Mg~(2+)对不同水稻(Oryza sativa L.)基因型苗期耐盐性的影响

【目的】进一步探明盐胁迫条件下营养元素K+、Ca2+和Mg2+对苗期不同水稻基因型耐盐性的影响差异,为明确作物耐盐胁迫的生理机制、提高作物耐盐胁迫能力提供参考。【方法】于2009年1—4月在严格控制水、温、光和营养元素供应的国际水稻研究所人工气候室进行水培试验,比较研究营养液中K+、Ca2+和Mg2+浓度的变化对不同水稻基因型苗期耐盐性的影响。【结果】在盐胁迫条件下(100mmol·L-1NaCl),耐盐基因型(FL478和IR651)与盐敏感基因型(IR29和Azucena)相比,植株体内有较低的Na+含量和Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/Mg2+比,有较高的K+含量,这些都是耐盐基因型耐盐胁迫能力高于盐敏感基因型的内在原因。盐胁迫条件下提高营养液中Ca2+和Mg2+的含量(60mg·L-1),可显著降低植株体Na+含量和Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/Mg2+比,明显减轻盐胁迫的危害,增强水稻耐盐胁迫能力,且Ca2+处理的效果优于Mg2+处理;而提高营养液K+含量对以上指标的影响远远小于Ca2+处理和Mg2+处理,这也是K+处理对水稻耐盐性影响相对不明显的内在原因。【结论】K+、Ca2+和Mg2+在植株体内的含量及其与Na+的比值变化都会影响水稻苗期耐盐性;适当提高水稻生长环境的Ca2+和Mg2+浓度可以明显增强植株耐盐胁迫能力,营养元素Ca2+的效果比Mg2+明显;而K+对水稻耐盐性的影响相对不明显。     

碱胁迫对不同品种菊芋幼苗生物量分配和可溶性渗透物质含量的影响

 【目的】探讨菊芋幼苗耐碱性与生物量和可溶性渗透物质在不同器官分配积累的关系。【方法】采用营养液砂培试验,以2个耐碱程度不同的菊芋品种‘南芋8号’（Ht 1,耐碱）和‘南芋1号’（Ht 2,耐碱性较弱）为材料,设置0.0、12.5、25.0以及37.5 mmol•L-1Na2CO3溶液模拟碱胁迫,研究其幼苗不同器官生物量分配和可溶性渗透物质含量的变化。【结果】碱胁迫下,2种菊芋幼苗各器官生物量比、Na+含量、K+含量、可溶性糖以及脯氨酸含量存在较大差异。相比之下,Ht 1在低碱胁迫（12.5 mmol•L-1）时叶片保持了较高的K+含量,根系积累了较多的干物质;较高碱胁迫（25.0,37.5 mmol•L-1）时叶片和根系积累了较多的可溶性糖,根系保持了较高的K+含量和较低的Na+含量,而Ht 2根系Na+含量、各器官脯氨酸含量以及茎可溶性糖含量在所有设定碱浓度下均较高。【结论】菊芋幼苗品种间耐碱性差异与其不同器官生物量和可溶性渗透物质的分配积累有关。耐碱菊芋品种低碱胁迫时叶片保持了较高的K+含量,根系分配了较多的干物质,较高碱胁迫时叶片和根系保持了较高的可溶性糖含量,根系保持了较高的K+含量和较低的Na+含量,这可能是其耐碱性较强的重要原因之一。     

海雀稗种质资源的耐盐性评价

对海雀稗耐盐体系进行优化,并通过测定坪用质量和枯黄率对27份海雀稗种质资源进行了耐盐性评价。结果表明,7个不同NaCl浓度（0,5,10,15,20,25,30 g·L?1）处理下,坪用质量、枯黄率和叶色各指标之间存在显著差异（P<0.05）。随着NaCl处理浓度的增加,坪用质量显著下降（P<0.05）,枯黄率显著增加（P<0.05）,叶色显著变浅（P<0.05）。建立回归方程,以枯黄率50%为标准,确定海雀稗最适盐处理浓度为25 g·L?1。利用25 g·L?1 NaCl对27份海雀稗种质资源进行耐盐性评价,筛选出2种极端耐盐种质:USA17-18（耐盐）和USA17-26（敏盐）。对海雀稗耐盐极端材料的钠钾离子含量进行测定,发现盐处理后,地上和地下Na+含量均显著增加,但K+含量和K/Na值都显著下降。减少Na+的摄入,维持较高的K+含量,可能是海雀稗耐盐的机制。     

高亲和钾转运体在植物抗盐中的作用

土壤盐渍化是导致作物减产的一项重要原因,Na+对大多数作物是有害的,而钾是植物不可缺少的营养成分,植物根系在外界低钾条件下主要通过高亲和性系统吸收K+.介绍了高亲和钾转运体Trk/HKT和KUP/HAK/KT 2大家族的结构和功能.主要讨论了当植物处于K+饥饿及盐胁迫下,2大家族在改善植物钾营养、提高植物耐盐性方面的作用.     

NaCl和Na_2SO_4对金露梅叶片胁迫效应

以不同浓度(0,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%)NaCl和Na2SO4溶液分别处理金露梅(Potentillafruticosa L.)2年生盆栽扦插苗,测定盐胁迫第7、13天后金露梅叶片的各项生理生化指标,为盐碱地区研究和开发具有耐盐性的野生花灌木提供参考依据。结果表明:在NaCl和Na2SO4胁迫下,随盐胁迫强度的增加和盐胁迫时间的延长,金露梅叶片的细胞膜透性,丙二醛(MDA)和脯氨酸含量均呈增加的趋势;可溶性蛋白含量随盐浓度的增加呈先增后降的趋势,随盐处理时间延长而有所下降。Na2SO4对金露梅的盐害超过NaCl的盐害。     

野大麦耐盐适应性反应机制的研究

【目的】探讨野大麦的耐盐适应性反应机制。【方法】采用原子吸收和X-ray微区分析等方法分析野大麦[Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link]在NaCl胁迫下幼苗生长、K+和Na+吸收、运输、分配及外排等生理响应。【结果】在NaCl≤350 mmol•L-1时，茎叶和根系的干重变化不明显，盐浓度的增加对根生长的抑制作用小于茎叶，根Na+含量增加的幅度小于茎叶、茎叶和根中K+含量均下降，但茎叶可维持较高的K+含量；野大麦具有较强的K+-Na+吸收选择性；低盐胁迫时Na+主要贮存于液泡和细胞间质；高盐胁迫时主要通过外排Na+来维持体内离子平衡。【结论】野大麦在NaCl≤350mmol•L-1时生长正常，其耐盐性与根拒绝吸收Na+及茎叶维持高K+含量有关，Na+区域化与外排可能是野大麦主要的耐盐适应性反应机制。     

不同品种花生耐盐性及Na~+吸收动力学特性

为了探究不同品种花生(花育20、花育25和花育36)幼苗的Na~+吸收动力学特性与耐盐性的关系,采用水培试验,研究了不同盐胁迫浓度下,不同花生品种幼苗的干物质积累变化、Na~+吸收动力学特性、Na~+吸收速率、Na~+排斥率与其耐盐性的关系。结果表明:花生对Na~+的吸收可分为高亲和、低亲和2个吸收阶段。低盐胁迫下,花生的Na~+亲和力常数(K_m)小,选择性强,Na~+排斥率平均值在85%左右;在高盐胁迫环境下为低亲和系统,K_m值大,Na~+最大吸收速率(V_(max))大,同时其排斥率较低。低盐胁迫下,花育20、花育25和花育36对Na~+的吸收速率较小,排斥率较高,Na~+积累慢,盐害轻;高盐胁迫下,花育20的Na~+吸收速率高于花育25和花育36,而Na~+排斥率低于花育25和花育36。因此高盐胁迫下,较高的Na~+吸收速率和较低的Na~+排斥率可能是花育20耐盐性弱于花育25和花育36的主要原因。     

问荆属3种药用植物生物量的研究

研究3种问荆属植物,问荆、林问荆、草问荆的生物量。采用样方法,在研究区域内设置1 m×1 m的样方,采挖后称其干重。结果表明,3种问荆属植物的生物量都主要集中在地上且靠近地面的部分,不同种类生物量在垂直方向的具体分布与其植株的分枝情况等生物学特性密切相关。