猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA方法的建立及应用

应用纯化的EMCV VP1重组蛋白建立了检测EMCV抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最佳工作条件。结果表明,重组蛋白抗原的最适包被浓度为0.54μg/mL;与间接免疫荧光试验比较,结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。此方法中VP1抗原最佳稀释度为1:100,待检血清的最佳稀释度为1:50,酶标二抗的最佳稀释度为1:800,1%明胶为封闭液,OD450时阴阳性血清的临界值为0.35。对2006年天津7个地区66个猪场295份屠宰猪的血清样本的检测结果显示,天津各地区血清EMCV抗体阳性率在41.67%～93.33%之间,平均84.75%,猪场抗体阳性率在50%～100%,平均93.94%。     

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625 μg/mL,待...     

检测猪脑心肌炎病毒重组非结构蛋白2C间接ELISA方法的建立

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)重组非结构蛋白2C作为包被抗原,确定间接ELISA反应的最佳工作条件;通过病毒阻断试验和交叉试验检验方法的特异性;通过与血清中和试验比较,确定方法的敏感性;通过对试验感染猪的血清2C抗体产生动态的检测,分析建立方法用于EMCV感染早期诊断的意义。结果显示,建立的间接ELISA方法能够特异地检出EMCV感染猪的血清2C抗体,与猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等的抗血清没有交叉反应;与血清中和试验检测结果的符合率为95.7%(22/23),相对敏感性为90.9%(10/11);仔猪感染EMCV后第4天,应用建立的间接ELISA方法即能够检出血清中的特异性2C抗体。结果表明,建立了可以替代血清中和试验的基于EMCV重组非结构蛋白2C的间接ELISA方法。     

鸡传染性贫血重组抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究应用重组抗原,成功建立了检测鸡传染性贫血病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法.确定了抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清最适稀释度为1:100,其作用时间为60min,酶标抗体最适作用时间为60min,S/P≥0.24为阳性,≤0.19为阴性,介于二者之间为可疑的判定标准.该抗原不与鸡其他疾病的10种阳性血清反应,具有良好的特异性;批内重复试验,变异系数小于10%,批间重复试验,变异系数小于15%,具有良很好的重复性;该方法可检出人工接毒后20d的血清抗体,直到试验结束110 d时,仍能检出鸡血清阳性率为81%与全病毒包被抗原ELISA方法的检测结果符合率达92%以上,与进口诊断试剂盒的符合率为97%.本研究为现地免疫鸡群抗体检测和进行CIA流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

猪伪狂犬重组抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究应用重组抗原,成功建立了检测猪伪狂犬病病毒血清抗体的间接ELISA诊断方法。通过方阵滴定确定了抗原最适包被量为1.45μg/孔,血清最适稀释度为1∶80,其作用时间为60 min,酶标抗体最适作用时间为60 min。其阳性临界值为OD≥0.123。此外,该抗原不与猪其他疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内重复试验,变异系数小于10%。该方法与进口诊断试剂盒的符合率为96.3%。本研究为现地免疫猪群抗体检测和进行PRV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

猪脑心肌炎的病原体和诊断

195 8年 ,在巴拿马首次诊断出猪脑心肌炎病毒 (en-cephalomyocarditis virus,EMCV)感染为猪的致死性疾病的病因〔1〕。随之 ,在比利时〔2〕、意大利〔3,4〕、美国〔5〕、加拿大〔6〕、日本 〔7〕、昆士兰 〔8〕、韩国 〔9〕等国家相继发生了猪脑心肌炎。以哺乳小猪心肌炎和高死亡率 ,以及母猪繁育障碍为主征 ,给养猪业造成了极大的损失。1　病原体猪脑心肌炎病毒 (EMCV)是引起猪脑心肌炎的病原体 ,它是一小的二十面体对称的单股正链 RNA病毒〔1 0〕 ,其大小为 18～ 30 nm,基因组长度为 7.8kb,属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)心病…     

猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立

本研究以纯化的原核表达猪传染性胃肠炎病毒N蛋白为诊断抗原，建立了猪传染性胃肠炎病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法，将其命名为mTGE-ELISA。该抗原不与其他常见10种猪病的阳性血清发生交叉反应。批内和批间重复性试验的变异系数均小于15％；对仔猪免疫后不同时间的血清检测结果表明mTGE-ELISA与纯化病毒ELISA符合率达95．0％；mTGE-ELISA相对于VN试验的敏感性为96．3％、特异性为92．2％：现地试验中，mTGE-ELISA与Svanova TGEV／PRCV antibody diagnosis Kit的符合率达87．0％，通过中和试验复核结果表明，mTGE-ELISA的假阳性低于Svanova TGEV／PRCV antibody diagnosis Kit。本试验建立的mTGE-ELISA诊断方法具有良好的敏感性和特异性，为免疫猪群抗体监测和TGE流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

犬瘟热病毒重组核蛋白间接ELISA方法的建立

将已构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL21株,在最佳诱导条件下获得犬瘟热病毒(CDV)重组N蛋白。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE和W estern-b lot分析,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。本研究初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经初步试验证实,该方法敏感、特异。试验结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然核衣壳蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原。     

基于重组NS1蛋白猪细小病毒野毒抗体间接ELISA诊断方法的建立与应用

本研究以原核表达的重组NS1蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒(PPV)野毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒5种常见猪病病毒的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;与血凝抑制试验(HI)符合率为100%。本研究建立的PPV NS1-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为PPV的野毒抗体检测及PPV流行病学调查等快速诊断提供了一种技术手段。     

牛轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

以纯化的原核表达的牛轮状病毒VP7蛋白为包被抗原,建立了检测牛轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他5种常见牛病病毒(IBRV、BCV、BRSV、ETEC、Cj)的阳性血清无交叉反应,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%;对来自不同牛场的血清样本检测结果显示,该检测方法与病毒中和试验检测结果符合率达87.2%。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为BRV的快速诊断、免疫牛群血清抗体监测及轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

猪轮状病毒重组VP7蛋白抗原间接ELISA诊断方法的建立

本研究以纯化的原核表达的猪轮状病毒VP7抗原表位区域为抗原,建立了检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他7种常见猪病病毒（TGEV、PEDV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV、PrV）的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10％;对来自不同猪场的血清的检测结果表明,该ELISA方法与中和试验检测结果符合率达94．8％。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

鸭疫里默氏杆菌重组蛋白P25间接ELISA检测方法的建立

以鸭疫里默氏杆菌血清1型（RA1）基因组文库中筛选获得的一种“保守假定蛋白P25”基因的重组表达产物为包被抗原，建立了检测RA血清抗体的间接ELISA。诱导表达的重组P25蛋白纯化后进行包被，十字交叉滴定试验确定，此ELISA的最适抗原包被浓度为0．6μg／mL，血清最佳稀释度为1：64，与大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌感染鸭血清无交叉反应。以RA1的P25为包被抗原对RA2、5、8、10血清型的标准分型血清和经临床剖检诊断的病鸭血清进行检测，其结果均为阳性。以RA1型的P25基因设计的特异性引物分别扩增出了RA2、5、8、10的P25基因。所扩增的P25基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列和抗原表位在这些不同血清型间高度保守，提示此P25蛋白是各种血清型RA间的共同抗原，所建立的ELISA可以用于检测不同血清型RA的感染。     

应用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体方法的建立

应用鸡胚成纤维细胞(CEF)扩增鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)并提纯后作为抗原建立了具有较高特异性和灵敏性的间接ELISA方法.通过方阵滴定法来确定抗原最佳包被浓度为2.7μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1:100,其阳性临界值为OD≥0.113.将400份FPV免疫实验鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为81.25%(325/400).此外,将该方法与琼脂扩散试验进行比较检测血清样品,结果显示本方法的灵敏度比琼脂扩散试验灵敏400～800倍,而且还有特异性强,操作简便、快速等优点.     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法,本研究利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法,并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔,抗原最佳包被条件为37℃放置2 h后,4℃下过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品,证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV抗体间接ELISA的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定

利用PCR方法扩增获得EMCV非结构蛋白3AB基因,并将其克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM中,提取阳性克隆质粒转化至DH10Bac感受态细菌,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacm id-3AB,经脂质体介导转染sf9细胞获得重组杆状病毒,并IFA和W estern b lotting鉴定其抗原性。结果表明,EMCV 3AB基因在昆虫细胞中获得成功表达,分子量约16 ku,具有良好的EMCV抗原性。因此利用杆状病毒表达系统成功表达了EMCV 3AB基因,为该病毒抗原表位和诊断方法研究奠定了重要基础。     

埃博拉病毒抗体间接血凝检测方法的建立

以纯化后的埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)糖蛋白(GP)作为抗原,致敏醛化的绵羊红细胞,进行最佳反应条件优化,建立间接血凝抗体检测方法。以EBOV高免马血清、纯化的IgG和精制免疫球蛋白F(ab’)_2为待检样品进行检测,并将检测结果与假病毒中和试验检测结果相比较。结果显示,该方法可特异性检测EBOV抗体,与马尔堡病毒、裂谷热病毒等的阳性血清均不发生反应;与假病毒中和试验测得的抗体效价增长规律相一致。结果表明,本试验成功建立了EBOV抗体间接血凝检测方法,该方法安全、简便、快捷,为EBOV疫苗免疫后的效果评价提供了又一新的检测方法。