山羊胚胎克隆的研究

应用细胞核移植技术，把未分化或处于不同发育阶段的胚胎分裂球或细胞移入成熟的去核卵母细胞，并使之融合，成为Ｇ＿０代克隆卵。将Ｇ＿０代克隆卵移入同期发情的山羊输卵管中培养５ｄ，回收得到克隆胚，选择其中正常发育至８～１６细胞的克隆胚，将其胚胎细胞再移入成熟的去核卵母细胞，并进行电融合，构成Ｇ＿１代再克隆卵。１２９枚Ｇ＿０代克隆卵和１４３枚Ｇ＿１代再克隆卵移入同期发情的山羊输卵管，获得Ｇ＿０代克隆羊２只和Ｇ＿１代再克隆羊４只。介绍了产生克隆动物的各个技术环节以及这些环节与克隆动物出生率的关系。     

波尔山羊胚胎徒手分割试验

在体视显微镜下，用含20％NCS的PBS液作为操作液，用显微玻璃针徒手分割波尔山羊早期囊胚。将13枚A级囊胚用于分割，其中11枚对称分割为两半胚，2枚为不对称分割。将13对半胚手术移植于13只同期发情的受体羊黄体侧子宫角．有5只受体妊娠，半胚移植受体妊娠率38．5％（5／13）。其中有2只妊娠受体发生流产，观察到3只流产胎儿，其余3只受体妊娠到期，获得3只正常半胚后代。     

世界首例胚胎克隆的波尔山羊在天津降生

2005年11月2日上午9时零51分，一只小羊羔在天津市畜牧兽医院研究所呱呱坠地，这是世界首例胚胎克隆的波尔山羊。     

山羊胚胎冷冻及移植试验

采用国产HIT-5型生物活体自动植冰冷冻仪,先后将33枚浏阳黑山羊7日龄胚胎进行冷冻,在-196℃的液氮中保存10.5±6.12d.将其中13枚形态结构基本正常的胚胎移植给7只同期发情的本地母山羊,结果有2只受体妊娠,产羔3只,受体妊娠率为28.57%(2/7),自制冻胚移植成功率为23.08%(3/13).     

山羊（Bore）-兔异种克隆胚胎连续核移植的研究

 以山羊-兔异种克隆桑椹胚卵裂球为核供体，兔卵母细胞为受体进行连续核移植研究，最终连续2次，共获得继Ⅰ代重构胚58枚，继Ⅱ代重构胚14枚。融合率分别为79.5%和70%，差异不显著（P>0.05）卵裂率分别为75.9%和28.6%,差异显著（P<0.05）。但继Ⅱ代重构胚最终未能发育至囊胚，继Ⅰ代重构胚囊胚率达到10.2%。     

布尔山羊异地采集胚胎与移植效果的研究

将55只饲养管理条件和超排处理方法相同的成年布尔山羊随机分成试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和对照组。各组供、受体羊的比例为1:13。试验Ⅰ、Ⅱ组分别经3和6h,在采卵前2~4h运抵采胚、移植地点,对照组在原饲养地采胚/移植。结果表明,试验Ⅰ、Ⅱ组供体羊平均每只采集有效胚12.91和13.38枚,对照组为15.30枚,但差异不显著。而膘情较好的试验Ⅰ组受胎率最高(71.29%),流产率最低(2.68%)。膘情较差的试验Ⅱ组受胎率最低(51.68%)流产率最高(9.09%);膘情居中的对照组受胎率(65.66%)和流产率(3.08%)介于前二者之中。     

牛-山羊异种体细胞克隆胚胎线粒体形态超微结构观察#br#

 【目的】通过对正常受精胚胎、山羊同克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)以及牛-山羊异种克隆胚胎(山羊去核卵与布尔山羊耳皮肤成纤维细胞重组)中线粒体超微结构的观察与比对,从亚细胞水平揭示异种克隆胚胎出现异常的原因,为异种克隆技术的进一步研究提供新思路。【方法】利用透射电镜分别对山羊正常受精胚胎、山羊同种克隆胚胎及牛-山羊异种克隆胚胎的原核、2-细胞、4-细胞、8-细胞及桑椹胚阶段的早期胚胎进行线粒体超微结构观察。【结果】山羊自然受精胚胎、山羊同种克隆胚胎的线粒体均为帽状,随着胚胎的发育,线粒体由电子密度高、嵴少的未成熟状态发育为电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体,而牛-山羊异种克隆胚胎从2-细胞胚胎至桑椹胚都存在一种具有多个分叶的线粒体,但这种形态异常的线粒体同样也能够形成电子密度低、嵴丰富的成熟线粒体。【结论】牛卵母细胞与山羊体细胞之间不能有效的进行核-质互作,本研究中具体表现为出现多分叶形线粒体,从而影响牛-山羊异种克隆胚胎的发育。     

波尔山羊胚胎回收和移植器械研制与应用

采用自己研制开发的波尔山羊胚胎手术回收和移植的关键器械，共进行122只供体的胚胎回收，回收供体卵巢上正常黄体总计2751枚，回收卵总数2504枚，回收率达到92．3％。采用这种自行研制的胚胎移植器械进行胚胎的子官移植，将2127枚波尔山羊胚胎移植给1182只受体，受体妊娠率达到63．0％（745／1182），证明该胚胎移植器械和制定的应用程序是可行的。     

山羊类胚胎干细胞的分离、克隆研究

从胚胎发育阶段、饲养层、生长因子等方面对影响山羊胚胎干细胞的分离、克隆的因素进行了研究。结果表明：囊胚期可作为分离山羊胚胎干细胞收集胚胎适宜阶段；小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和山羊胚胎成纤维细胞(GEF)对山羊类ES细胞分离效果影响不明显；生长因子LIF和SCF配合使用可分离到山羊的类ES细胞，并传至第4代。     

SAHA处理供体细胞对山羊克隆胚胎早期发育的影响

为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂羟肟酸(SAHA)对体细胞和山羊核移植胚胎早期发育的影响,采用不同浓度SAHA处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其AcH3K9水平、细胞增殖能力、细胞周期及胚胎发育情况、乙酰化水平、多能性基因的表达水平。结果显示,SAHA处理后GEFs的AcH3K9水平显著上升(P0.05),2.5μmol/L SAHA处理浓度即可显著提高GEFs组蛋白H3K9的乙酰化水平;浓度≤2.5μmol/L时,对细胞增殖能力无明显影响;浓度为5.0μmol/L和10.0μmol/L时,细胞活力显著下降(P0.05)。AcH3K9上调会引起G0/G1和S期的细胞比例下降(P0.05)。因此,选择经2.5μmol/L SAHA处理的供体细胞进行核移植。试验组的胚胎卵裂率和囊胚率显著高于对照组(P0.05),其卵裂率接近于卵胞质单精子注射(ICSI)组。试验组的囊胚率乙酰化水平显著高于对照组,且低于ICSI组(P0.05)。与对照组相比,试验组囊胚的Oct4、Sox2和Nanog的mRNA表达水平均上升(P0.05),且均接近于ICSI组。说明,选用2.5μmol/L SAHA处理供体细胞可提高体细胞核移植效率和胚胎品质。     

四川省波尔山羊胚胎移植操作规程的研究

根据四川省的生产条件,进行了波尔山羊胚胎移植操作规程的研究。从波尔山羊胚胎移植中准备工作及实施方案的制定开始,对供、受体羊选择与饲养管理,供体羊超排技术与胚胎回收、鉴定技术,受体羊同期发情与胚胎手术移植技术,以及供、受体羊术后管理等系列化操作规程进行了研究与确定。     

安哥拉山羊胚胎冷冻试验

对安哥拉山羊用总量350IUFSH按递减法处理,配种结束后第6天经子宫手术回收桑椹胚和囊胚供冷冻试验.选用1.4mol/L甘油、1.2mol/L和1.5mol/L乙二醇做防冻保护剂,快速冷冻,-36℃投入液氮保存.采用直接水浴或在空气中停留6～10s使胚胎温度回升,再水浴解冻.胚胎解冻后,用0.5mol/L蔗糖PBSS脱除保护剂,移入2%PBSS中,手术移植于发情后6d的适移受体.结果表明,1.5mol/L乙二醇具有良好的冷冻保护作用.在18～20℃空气中使胚胎温度稍回升,再水浴解冻,可降低胚胎解冻过程中热应激导致的透明带破损,移植于适移受体的妊娠率达45.5%.     

布尔山羊胚胎移植试验研究

2001年9-12月份，应用2种超排方案对35只布尔山羊（其中经产羊30只，处女羊5只）进行了超排处理，并对180只受体进行了胚胎移植。结果表明：35只供体共回收胚胎471枚，可用胚为349枚，可用胚胎率为74.10％（349/471），每只平均获胚胎11.91枚，只均可用胚9.97枚。其中经产羊30只，平均每只获胚胎12.43枚，只均可用胚胎10.37枚；处女羊5只，平均每只获胚胎8.8枚，只均可用胚胎7.6枚。鲜胚移植受体180只，每只1枚，妊娠率为63.89％（115/180），另外，试验表明，不同剂量的FSH对超排效果也有一定的影响。     

山羊胚胎移植受体同期发情优化程序研究

用国产炔诺酮阴道栓、促卵泡素(FSH)和氯前列烯醇(PG)组成3种诱导山羊同期发情的处理程序,分别对579、889和673只四川本地山羊进行同期发情处理.结果表明,设计的3种同期发情处理程序都有较好的同期发情效果,同期发情有效率分别为88.9 %(515/ 579)、91.9 %(817/ 889)和96.4 %(649/ 673),处理羊同期发情后正常排卵并形成功能黄体的比率分别为67.6 %(348/ 515)、66.1 %(540/ 817)和70.9 %(460/ 649).处理程序结束后,从撤除炔诺酮阴道栓到母羊开始发情的间隔时间分别为47.3±16.4、47.0±18.7和42.7±16.4 h,各组发情羊发情持续时间分别为43.9±16.5、41.5±17.9和44.1±16.4 h.总的来看,使用PG-炔诺酮阴道栓-FSH-PG处理法,同期发情总有效率最好.     

不同品种受体对波尔山羊胚胎移植效果的研究

将2127枚波尔山羊胚胎移植给1182只受体,移植单胚、双胚、3胚和4胚时的受体妊娠率分别为60.2%(171/ 284)、62.7 %(540/ 862)、64.0 %(16/ 25)和54.6 %(6/ 11),胚胎成羔率分别为60.2 %(171/ 284)、51.6 %(890/ 1724)、41.3 %(31/ 75)和36.4 %(16/ 44).各品种受体移植单胚时妊娠率和胚胎成羔率均无显著差异(P＞0.05),移植双胚的奶山羊受体胚胎成羔率显著高于成都麻羊和简阳大耳羊(P＜0.05),而南江黄羊低于奶山羊、高于成都麻羊和简阳大耳羊,但差异不显著(P＜0.05).受体羊卵巢上黄体数量对受体妊娠率和胚胎成羔率无明显影响,但随着黄体体积变小,胚胎成羔率逐渐下降.     

胚胎移植波尔山羊早期生长发育的研究

[目的]初步掌握胚胎移植波尔山羊的生长发育规律。[方法]以胚胎移植生产的波尔山羊为试验动物,同期出生的自然繁殖波尔山羊为对照,分别测定波尔山羊的初生重、1月龄、3月和6月龄体重,3月龄和6月龄波尔山羊体尺,并观察记录羊只的健康状况。[结果]胚胎移植波尔山羊在正常饲喂条件下,早期生长发育快,肉用体型明显;公羔平均初生重为(4.25±0.95)kg,母羔为(3.74±0.10)kg,6月龄公羊平均体重为(31.90±0.74)kg,母羊为(25.90±0.67)kg,从出生到6月龄的日增重,公、母羊分别为153.64、123.11g;体长、体高、胸围等增加明显。体重、体尺测定结果与自然繁殖羔羊差异不显著。[结论]该研究为进一步探讨胚胎移植波尔山羊早期的选种利用奠定基础。     

山羊SDHD基因cDNA编码序列的克隆与分析

利用NCBI中GenBank里查询到已登录的人、猪、牛和绵羊的SDHD mRNA序列,通过多重同源比较,从而获得高度保守区域序列,设计了同源引物,并首次对山羊SDHD编码序列进行了分子克隆。经过PCR扩增和测序,获得山羊SDHD基因共4段cDNA序列,分别为:451 bp4、20 bp5、29 bp和698 bp。所获得的四段序列测序结果经La-sergene7.0软件SeqMan拼接后,获得一条1238 bp长的cDNA序列。在GenBank数据库中进行BLAST/nr比对,发现其与绵羊、牛、猪和人相应序列相似性分别达98%、97%、85%和81%。用NCBI的ORF Finder软件对已经克隆的山羊SDHD基因cDNA进行开放阅读框分析,发现该序列包含一个480 bp的开放阅读框,编码159个氨基酸残基,计算机分析表明(Compute pI/Mw tool),该蛋白的分子量约为17 224.11 Da,等电点为8.92。通过DNAMAN软件分析发现,山羊SDHD蛋白保守性很高,其与绵羊、牛、猪和人SDHD蛋白在氨基酸序列上的相似性分别达到97%、96%、87%和85%。此山羊SDHD基因cDNA序列和SDHD蛋白质序列已于2010年1月31日登录在NCBI的GenBank上,登录号为GU338978和ADB92501。本项研究为进一步研究山羊的SDHD基因作为山羊肉品质性状候选基因,提供了相应的序列信息。     

用玻璃化冷冻保存山羊胚胎的研究

试验用下班化冷冻保存山羊胚胎１４２枚，其中３５枚移植受体１３只，妊娠率和产羔率分别为６１．５％（８／１３）和４０％（１４／３５）；１０７枚（桑椹胚４４枚和囊胚６３枚）在液氮中保存３和４．５年后解冻与培养。结果表明，桑椹胚形态和发育正常率分别为４７％（２１／４４）和３８．６％（１７／４４），囊胚分别为６３．５％（４０／６３）和４７．６％（３０／６３）。囊胚解冻后形态正常率和发育率显著高于桑椹胚