毛白杨labA-1ikel基因的克隆与表达特性及其表达载体的构建

利用滤纸吸附噬菌体一PCR法,从毛白杨花芽cDNA文库中分离克隆了PtlabA-1ikel基因cDNA全长序列。在Conserved Domains Database（CDD）中对该基因氨基酸保守结构域进行分析,发现其包含一个LabA—like superfamily结构域,故将其命名为PtlabA—likel。经BL...     

毛白杨labA-1ikel基因的克隆与表达特性及其表达载体的构建

利用滤纸吸附噬菌体一PCR法,从毛白杨花芽cDNA文库中分离克隆了PtlabA-1ikel基因cDNA全长序列。在Conserved Domains Database（CDD）中对该基因氨基酸保守结构域进行分析,发现其包含一个LabA—like superfamily结构域,故将其命名为PtlabA—likel。经BLAST分析,在毛果杨基因组数据库中检索到含有该保守结构域的其他9个家族成员。运用BioEdit和MEGA3．1软件,绘制了该基因家族表达蛋白的系统进化树。通过RT—PCR分析,揭示了该基因及其他家族成员在毛白杨中的组织差异表达模式：PtlabA—likel、PtlabA—like6呈现相似的组织表达模式,在茎、幼叶、成熟叶和雌雄花芽组织中均表达,但PtlabA—likel表达丰度较高;PtlabA—like8只在根部表达,且表达丰度较低;其他成员在根、茎、成熟叶、幼叶和雌雄花芽组织中均有表达,但是不同成员的表达丰度存在一定的差异。为进一步研究该基因的功能,构建了该基因的正义表达载体。     

MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系优化研究

为了建立农杆菌介导的高效毛白杨遗传转化体系,并大量获得转MdSPDS1基因的转基因毛白杨,对MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系中关键转化因子进行了优化。获得的优化转化体系如下:叶片预培养3d后,用OD600为0.4的菌液侵染7min,再共培养3d。卡那霉素抗性芽的二次筛选中,卡那霉素的选择压分别为20和50mg/L。实验获得毛白杨卡那霉素抗性植株共43株,经PCR检测,其中9株呈阳性,占抗性植株总数的20.9%,优化转化系统的阳性植株转化率达到9.38%。本研究为下一步鉴定基因功能和转基因植株耐盐性的分析奠定了基础。     

青杨伐根嫁接毛白杨技术试验初报

在人工伐除除青杨后的伐根上嫁接毛白杨,试验结果表明:嫁接平均成活率91%,接穗平均成活率86.5%,当年平均苗高1.43 cm,平均地径1.64 cm.     

毛白杨TIR-NBS-LRR基因转化烟草的研究

该文采用农杆菌介导法将从毛白杨中克隆得到的TIR-NBS-LRR抗病基因（PtDRG01）导入烟草中,经抗生素筛选和PCR分子检测,获得了一批阳性转化植株。进而对这些阳性转化植株进行烟草花叶病毒接种实验,从表型观察结果发现,在接种病毒1周和6周后,转基因烟草株系TG-11的发病程度明显低于非转基因烟草。荧光定量分析结果显示,转基因烟草株系TG-11叶片中的烟草花叶病毒(TMV)数量显著低于非转基因植株,且该转基因株系中的PtDRG01基因转录水平显著高于非转基因植株。这些结果表明,毛白杨PtDRG01基因具有明显的抗病功能,其高效表达能够显著提高烟草的抗TMV能力。该文通过对烟草的遗传转化与病毒接种实验,鉴定了PtDRG01基因的功能,可为其他TIR-NBS-LRR基因的功能鉴定提供参考。      

PTLF基因RNAi结构转化毛白杨的研究

[目的]PTLF是杨树花发育的重要基因,可抑制杨树开花,解决杨树飞絮散粉污染环境的问题,并降低生殖生长对营养生长的竞争。[方法]利用农杆菌介导的叶盘转化法将含PTLF基因的RNAi（RNAinterference）载体35S-PTLF-IR转化毛白杨。[结果]通过聚合酶链式反应（PCR）检测,初步验证10株阳性转化植株。[结论]对转基因毛白杨和野生型毛白杨组培苗进行高生长分析表明,前者生长速度、株高低于后者。     

RolB基因对三倍体毛白杨的转化研究

为了提高三倍体毛白杨的生根能力,把rolB基因转入三倍体毛白杨中,获得20个转化植株,在无激素培养基上,转化植株的生根率达到100%,而未转化植株的生根率只有15%~20%。PCR扩增证明目的基因已经插入到植物的基因组中。对部分rolB基因转化植株进行了GUS组织化学染色检测,转化植株叶片中有GUS活性的表达。     

毛白杨85号高效遗传转化系统的建立

在建立以毛白杨85号(Populus tomentosa 85)叶片为外植体的再生系统基础上,从预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性植株作为转化率的衡量指标,研究了各因素对毛白杨85号遗传转化率的影响,建立了高效的遗传转化系统。筛选的高效转化系统为:农杆菌活化菌液用MS液体培养基稀释10倍,浸染5min,共培养4d。毛白杨85号叶盘转化率可达40.0%。该研究为利用叶盘法开展毛白杨85号基因转化培育抗逆新品种奠定了良好基础。     

毛白杨优树基因资源形态性状的遗传多样性研究

以毛白杨全分布区１０省市选出了１０４７株优树，分别收集其根和花枝作为繁殖材料，建立两种形式的基因库：档案库和标本园，以花植标本园中５８０个毛白杨无性系为对象，调查９年生各种形状性状，计算其多样性指数，燕进行变异分析和文科左分析，同时分析优树调查登记表中各种形态性状的变异。     

毛白杨4CL-like基因的克隆与原核表达分析

为得到毛白杨4CL-like基因并对其原核表达特性进行分析,利用毛白杨叶片的总RNA反转录得到的总cDNA为模板,利用PCR技术克隆得到毛白杨4CL-like基因(登录号:XP_002315339.1).利用MEGA软件对4CL-like基因及其他9个来自不同物种的4CL基因进行进化树分析.最后通过构建pET30-4CL-like原核表达载体对该基因进行原核表达分析.结果显示,克隆得到的4CL-like基因CDS区全长为1 758 bp,编码585个氨基酸.系统进化分析表明,该基因与葡萄中的4CL-like5有很高的同源性.另外,SDS-PAGE分析表明,4CL-like基因在大肠杆菌BL21中成功表达,所表达融合蛋白的分子量约为60 ku.     

3个毛白杨病程相关蛋白基因的克隆及表达

运用电子克隆及RT-PCR技术,以水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导下的毛白杨（Populus to-mentosa Carr.）叶片总RNA为模板,分离获得3个病程相关蛋白基因,分别命名为PtPR-1、PtPR-5与PtPR-10。生物信息学分析后发现,这3个基因所编码的蛋白PtPR-1、PtPR-5和PtPR-10分别具有SCP、THN和Bet_v1保守结构域,其中PtPR-1和PtPR-5均包含一段25 bp的信号肽,成熟蛋白序列与其他物种相比同源性较高;而PtPR-10无信号肽,蛋白序列与其他物种相比差异性较大,其基因组序列还存在一段91 bp的内含子。另外,实时荧光定量PCR技术分析结果表明,SA和MeJA处理后,PtPR-1与PtPR-10表达模式和转录水平均有较大差异,而Pt-PR-5的表达则未见显著变化,由此可推测,PtPR-1可能受SA和JA双重诱导,而PtPR-10可能只受SA诱导表达,在SA和JA两种信号通路的互作下,表现出不同的诱导表达模式。     

毛白杨AP2/ERF 类转录因子PtoSHN 的克隆及分析

AP2/ERFs是一个庞大的转录因子家族,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用.以毛白杨(Populus tomentosa)为材料,克隆了毛白杨AP2/ERF类转录因子PtoSHN的编码区序列.组织表达特异性结果显示,PtoSHN基因在毛白杨茎中高水平表达.系统进化分析表明,PtoSHN与拟南芥AtSHN2和AtSHN3相似度较高,其中AtSHN2已被证明参与了植物次生壁的合成调控.通过亚细胞定位预测,PtoSHN定位于细胞核内.亚细胞定位结果表明,PtoSHN定位在核内.表明已成功克隆到毛白杨SHN基因,该基因可能在林木次生生长过程中起调控作用.     

毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

为了发掘我国乡土树种毛白杨巯基蛋白酶抑制剂(CPI)基因资源,该研究在对已知植物巯基蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守性和杨树表达序列标签(EST)序列分析的基础上,设计了1对简并引物和1对杨树特异性CPI引物,应用RT-PCR技术在毛白杨形成层中扩增出了一个696 bp的cDNA片段,将此片段连接到pGEM-T Easy载体上并测序.结果表明,该片段含有一个417 bp的开放阅读框,编码138个氨基酸残基.进一步对氨基酸序列分析表明,该氨基酸具有典型植物巯基蛋白酶抑制剂的保守区段,即靠近氨基端具有甘氨酸（G）残基和［LVI］-［AGT］-［RKE］-［FY］-［AS］-［VI］-［EDQV］-［HYFQ］序列,羧基端具有与酶活性有关的QXVXG结构和PW残基,说明毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木CPI的同源性在47%～68%之间.      

毛白杨遗传作图最适分离群体的选择

该研究以毛白杨及其杂种毛新杨和银白杨与腺杨的杂种银腺杨为材料 ,利用控制授粉杂交和种子组织培养技术相结合制备了 3个规模较大的遗传作图群体 .在此基础上 ,采用扩增性片段长度多态性 (AmplifiedFragmentLengthPolymorphisms,AFLPs)标记技术对这些作图群体的亲本进行了多态性检测 ,结果表明 :8对EcoRⅠ MseⅠ引物组合在毛新杨无性系TB0 1×毛白杨无性系LM5 0作图群体亲本间的多态性水平最高 ,平均可检测到 2 0个多态性位点 .结合对子代在田间表型性状分离情况 ,选取了该分离群体作为构建毛白杨遗传连锁图的作图群体 .并利用AFLP技术对随机抽取的 12 0株子代个体进行了基因型检测 ,10对AFLP引物组合在作图亲本间共检测到 197个多态性位点 ,其中有 15 8个位点在P <0 0 1水平上符合 1∶1孟德尔期望分离比 ,占多态性位点总数的 80 2 % ,选取该群体作为构建毛白杨遗传连锁图的作图群体是合适的     

毛白杨4-CL cDNA的克隆、表达及活性分析

从毛白杨(Populus tomentosa)木质化茎中提取总RNA,利用RT-PCR技术进行cDNA扩增,获得1条1 621 bp的片段。测序结果表明:该片段编码536个氨基酸组成的多肽,序列中包含所有已知4-CL蛋白的2个特征序列boxⅠ(SSGTTGLPKGV)和boxⅡ(GEICIRG)。将cDNA克隆到原核表达载体pET-32a( )中,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3)。IPTG诱导后,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,4-CL基因在大肠杆菌BL21中获得表达,所表达融合蛋白的分子量约为70 ku。酶活性分析表明:该重组蛋白对底物PA、FA、CA均表现出催化活性,其偏爱性顺序为PA>FA>CA,对SA则没有活性。     

毛白杨抗坏血酸过氧化物酶基因PtAPX2的克隆表达及分析

以毛白杨总RNA为模板反转录得到cDNA,克隆获得抗坏血酸过氧化物酶基因家族中的一个成员PtAPX2 864 bp的编码序列。该基因编码的蛋白包含287个氨基酸,理论分子质量为3178 ku,C末端包含锚定于过氧化物酶体跨膜结构域,推断其为过氧化物酶体定位蛋白。构建了PtAPX2原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了纯化的重组蛋白,并对其进行了酶学性质分析。PtAPX2对抗坏血酸的Km值为 (1.37±0.22) mmol/L,Vmax值为 (3.95±0.46) mmol/(L•min•mg);对H2O2的Km值为 (0.026±0.003) mmol/L,Vmax值为 (1.27±0.03) mmol/(L•min•mg);该酶在28 ℃,pH 7.0～7.4时活性最高。实时荧光定量PCR分析表明,PtAPX2在杨树老叶叶肉中表达量最高。对PtAPX2亚细胞定位、底物结合特征、酶学性质及组织特异性表达的分析加深了对木本植物抗氧化机理的认识。      

毛白杨AP2/ERF 类转录因子PtoSHN 的克隆及分析

AP2/ERFs 是一个庞大的转录因子家族,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用。以毛白杨(Populustomentosa)为材料,克隆了毛白杨AP2/ERF 类转录因子PtoSHN 的编码区序列。组织表达特异性结果显示,PtoSHN 基因在毛白杨茎中高水平表达。系统进化分析表明,PtoSHN 与拟南芥AtSHN2 和AtSHN3 相似度较高,其中AtSHN2 已被证明参与了植物次生壁的合成调控。通过亚细胞定位预测,PtoSHN 定位于细胞核内。亚细胞定位结果表明,PtoSHN 定位在核内。表明已成功克隆到毛白杨SHN 基因,该基因可能在林木次生生长过程中起调控作用。     

毛白杨PtYABBY基因家族3个成员的克隆与表达分析

  目的  YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。  方法  以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。  结果  PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C₂C₂锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。  结论  YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。