中药有效成分诱导肺微血管内皮细胞表达IFN-γ的研究

以体外培养的RPMVECs(rat pul monary microvascular endothelial cells,RPMVECs)为模型,采用双夹心ELISA法和MTT法,研究了绿原酸、连翘酯苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素诱导RPMVECs表达IFN-γ(inferteron-γ)的影响以及对PMVECs的毒性。ELISA检测结果表明,加入质量浓度为5,10,20,50,100μg/mL的5种中药成分刺激细胞16 h后,在培养细胞上清液内均能检测到IFN-γ,其中绿原酸、黄芩素组IFN-γ的表达量随药物浓度增大而减少;连翘酯苷组IFN-γ的表达量均较多;黄芩苷、汉黄芩素组均在10μg/mL时IFN-γ的表达量达到峰值,随后IFN-γ的表达量随浓度增大而减少。MTT检测结果显示,各浓度的黄芩苷、黄芩素对PMVECs均有一定程度的抑制作用,而连翘酯苷对PMVECs均有增殖作用,绿原酸、汉黄芩素的细胞毒性则随药物浓度而发生变化。     

黄芪多糖和黄芪甲苷诱导RIMVECs分泌IFN-γ的研究

【目的】探明黄芪甲苷和黄芪多糖能否诱导RIMVECs分泌IFN-γ,为黄芪及有效成分的临床应用提供理论和参考依据。【方法】以体外培养的RIMVECs为模型,用ELISA法检测不同浓度的黄芪甲苷和黄芪多糖在不同时间诱导RIMVECs分泌IFN-γ的表达量。【结果】25μg/mL和50μg/mL黄芪甲苷能诱导RIMVECs表达IFN-γ,且随着时间延长表达逐渐升高,24h时达到峰值,具有明显的富集效应;25μg/mL和50μg/mL黄芪多糖也能诱导RIMVECs表达IFN-γ,随着时间延长RIMVECs细胞上清液中IFN-γ表达量逐渐增多,25μg/mL组IFN-γ表达量24h达到峰值;50μg/mL组IFN-γ表达量12h达到峰值,随后表达量降低。【结论】结果提示,黄芪甲苷和黄芪多糖的免疫调节作用可能是通过诱导RIMVECs分泌IFN-γ来实现,为黄芪的临床应用提供了试验依据。     

猪抗病毒蛋白基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立

根据GenBank中的猪抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx核苷酸序列设计特异性引物,经RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增和克隆了PKR、OAS/RNase L及Mx的101 bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx标准曲线及其直线回归方程;该方法具有线性关系好,特异性、敏感性、重复性高等特点;建立的荧光定量PCR方法可检测抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx mRNA水平。为猪体内抗病毒蛋白PKR、OAS/RNase L及Mx的mRNA水平的定量检测提供必要的技术。     

二甲基苯蒽诱导山羊乳腺上皮细胞体外转化研究

分别用5,10和15μg／mL二甲基苯蒽(DMBA)的完全培养液处理体外培养的山羊乳腺上皮细胞36, 24和12 h,再以25 ng／mL佛波酯(TPA)作用2周,研究DMBA和TPA对山羊乳腺上皮细胞的诱导转化作用,确定最佳诱导转化条件,探讨二甲基亚砜(DMSO)对细胞增殖的影响。结果表明,用含15μg／mL DMBA的完全培养液培养12 h,再用TPA连续作用4 d,几乎无山羊乳腺上皮细胞存活,10μg／mL DMBA培养24 h转化效果较差,5μg／mL DMBA培养36 h转化效果最佳;转化的山羊乳腺上皮细胞体积增大、核浓缩、生长排列紊乱、无规则并出现转化灶; DMSO对细胞生长有抑制作用．随培养时间延长抑制作用减弱。试验初步建立了乳腺上皮细胞的体外转化系统。     

连翘酯苷对IFN-α和Mx1表达的影响

 【目的】探讨连翘酯苷作用于感染PCV2的小鼠模型后,对IFN-α和Mx1表达的影响,以评价连翘酯苷的抗病毒作用。【方法】复制PCV2感染小鼠模型。以(2、4、10 mg?mL-1)连翘酯苷分为高、中、低 3个剂量组,并设空白对照组和病毒对照组。给药12、24、36 h后,分别提取小鼠肺组织总RNA和总蛋白,应用实时荧光定量PCR检测IFN-α、Mx1 mRNA含量,采用Western blotting检测Mx1蛋白的表达水平。【结果】空白对照组小鼠肺组织中Mx1和IFN-α无表达,病毒对照组少量表达。随着连翘酯苷浓度的升高,IFN-α和Mx1 mRNA水平逐步升高,两者的表达量呈现平行相关;高剂量组中IFN-α和Mx1表达量最高(P＜0.001);随着药物作用时间的延长表达量降低,12 h时达到最高(P＜0.001),其后逐渐下降。【结论】昆明小鼠适于PCV2感染模型的建立。中药连翘酯苷能显著上调IFN-α和Mx1的表达,并在给予高剂量药物后12 h发挥显著的抗病毒作用。Mx1蛋白与病毒的感染密切相关,可用于病毒感染的早期诊断,及具有较好的应用前景。     

PolyⅠ:C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础.[方法]依据GenBank上斑马鱼(AJ852023.1)和鲫鱼(AY293929.1)的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100 μg/ml Polyl:C体外分别处理草鱼肾细胞(Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK)12、36、48h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中PKR基因.[结果]处理12h时未扩增出PKR基因,处理36和48h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00％和81.48％.[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,Polyl:C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路.     

PolyI：C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼（AJ852023.1）和鲫鱼（AY293929.1）的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物; 采用100μg/ml PolyI：C体外分别处理草鱼肾细胞（Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK）12、36、48h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中 PKR 基因。[结果]处理12h时未扩增出PKR基因,处理36和48h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00%和81.48%。[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,PolyI：C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路。     

PolyI：C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼（AJ852023.1）和鲫鱼（AY293929.1）的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100μg/ml PolyI：C体外分别处理草鱼肾细胞（Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK）12、36、48 h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中PKR基因。[结果]处理12 h时未扩增出PKR基因,处理36和48 h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00%和81.48%。[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,PolyI：C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路。     

RP-HPLC法测定安石榴苷在大鼠血浆中的浓度及其药动学研究

建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定安石榴苷的血药物浓度,并用于大鼠灌胃后的药动学研究。采用COSMOSIL-Cholester C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5μm),以甲醇-0.1%磷酸为流动相梯度洗脱,检测波长370 nm,柱温40℃,流速1.0 mL/min。SD大鼠单次口服安石榴苷(300mg/kg)后,眼眶静脉丛采血,检测24h内11个时间点血浆中的药物浓度。安石榴苷在2.18～58.00μg/mL范围线性关系良好,定量下限(LLOQ)2.18μg/mL,日内、日间精密度RSD <15%提取回收率为89.67%～115.5 6%。PK Slutions 2.0^TM药动学软件拟合主要药动学参数C_max、T_max、AUC₍(0-t))分别为(26.33±5.65)μg/mL、(1.67±0.52)h和(243.40±111.62)(μg·h)/mL。所建立RP-HPLC法测定安石榴苷的血药浓度简便、准确、专属性强,给大鼠灌服安石榴苷后,其吸收、分布迅速,体内药动学...     

3种中药在体外对PEDV的抑制作用

[目的]筛选抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的有效中药单体及其作用节点。[方法]选择3种中药单体进行体外抗病毒试验，通过对病毒3个节点(抑制吸附穿入、直接杀灭、抑制复制)进行药物作用，评价CCK-8法、间接免疫荧光法和Western blot的对抗病毒效果。[结果]黄芩苷和水飞蓟在病毒吸附和穿入阶段抗病毒效果好，而诃子抗病毒效果较差；CCK-8测试显示，黄芩苷和水飞蓟最大抑制率分别为82.34%和78.00%,间接免疫荧光和Western blot进一步验证黄芩苷和水飞蓟能降低绿色荧光强度及抑制病毒N蛋白的表达，且2种药物抗病毒作用均呈现一定的浓度依赖性。[结论]该研究结果可为后续抗PEDV药物的筛选提供科学依据。     

Baicalin Induces IFN-α/β and IFN-γ Expressions in Cultured Mouse Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

We studied the effect of baicalin, an extract from Radix Scutellariae (a traditional Chinese medicine) in inducing mouse pulmonary microvascular endothelial cells (MPMVECs) to produce interferons (IFNs). MPMVECs were cultured in vitro in the presence of different concentrations of baicalin (10, 20, and 30 μg mL-1), and the cells and the culture media were harvested at various time intervals. The proteins and mRNA levels (relative to β-actin) of IFN-α/β and IFN-γ were analyzed by RT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). It was observed that baicalin substantially up-regulated the expression of IFN-α/β and IFN-γ. In all baicalin-treated groups, the relative levels of IFN-α/β and IFN-γ mRNAs peaked after 12 h of culturing, and IFN-α/β and IFN-γ proteins peaked after 24 h of culturing. These results suggest that baicalin can effectively induce the expression of IFNs in pulmonary microvascular endothelial cells, and thus potentially act as an antiviral compound. This study may provide background information for developing new antiviral drugs based on baicalin.     

复方制剂中黄芩甙成分在奶牛血浆和乳中药动学的研究

文章以高效液相色谱 (HPL C)法为定量手段 ,研究复方制剂中黄芩甙经子宫内灌注给药后在奶牛血浆和乳汁中药物代谢动力学特征。采用 MCPKP药代动力学程序处理药时数据 ,分析黄芩甙在血浆和乳中的药动学参数。结果表明 ,黄芩甙在血浆、乳中的药动学特征均符合一级吸收一室开放模型。黄芩甙在血浆中的主要药动学参数为 :C0=0 .37︼g· m L- 1 、Ka=1.73· h- 1 、K =0 .2 5· h- 1 、t1/ 2 Ka=0 .70 h、t1/ 2β=2 .93h、Cm ax=0 .2 4︼g· m L- 1 、Tmax=2 .2 3h、AU C=1.5 2 m g· (L h) - 1 、Tlag=0 .5 0 h。黄芩甙在乳汁中的主要药动学参数为 :C0 =0 .76︼g· m L- 1 、Ka=0 .88· h- 1 ,K=0 .38h- 1、t1/ 2 Ka=0 .79h、t1/ 2 β=1.82 h、Cm ax=0 .31︼g· m L- 1、Tmax=3.2 7h、AU C=2 .0 0mg· (L h) - 1、Tlag=1.6 0 h。     

鸭维甲酸诱导基因I克隆及其结构域功能分析

【目的】克隆鸭维甲酸诱导基因I（retinoic acid inducible gene I,RIG-I）,分析其不同结构域的功能。【方法】根据GenBank上公布的鸭RIG-I序列设计引物,利用RT-PCR克隆鸭RIG-I基因CDS（coding sequence）区,根据保守结构域预测结果,构建携带6*his组氨酸标签的不同结构域缺失突变体的真核表载体（RIG-I-Full、RIG-I-N和RIG-I-C）,转染鸡胚成纤维细胞DF1,经RT-PCR、间接免疫荧光方法鉴定重组质粒在细胞中转录与表达;同时,利用RT-qPCR检测RLR抗病毒信号通路中的IFN-β、Mx1和PKR等下游基因的表达变化。【结果】鸭RIG-I基因CDS区全长2 802 bp,共编码933个氨基酸;不同结构域缺失突变体的真核表载体转染DF1细胞后,重组蛋白均在DF1细胞中表达;RT-qPCR结果显示,N端能显著激活RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达上调。【结论】 duRIG-I及不同区段均能在DF1细胞中表达,其中N端在调节RLR抗病毒信号通路下游基因的表达过程中发挥了重要作用。     

Pharmacokinetics of Two Ingredients of the Compound Chinese Herbal Medicine Transdermal Preparation in Cows

The topical administration of the compound Chinese herbal medicine transdermal preparation has been widely used in treating the mastitis of cows. In order to understand the metabolic process, four cows suffering from clinical mastitis were selected for the pharmacokinetic study. The transdermal preparation was applied to the diseased part of breast. Then the plasma and milk samples were collected respectively at 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, and 36 h, The concentrations of baicalin and phillyrin in plasma and milk were determined by HPLC and the data of time-concentrations were analyzed by the pharmacokinetic software. The results showed that two ingredients in the plasma were not detectable, but they in the milk had linear relationship with the time. The peak concentration of baicalin [（2.84 ±0.15）μg mL^-1] appeared at （4.93 ± 0.35） h, AUC0.1OQ was （27.32 ± 7.91） mg L^-1 h^-1, and the mean retention time was （28.31 ±0.49） h. The peak concentration of phillyrin [（0.49 ± 0.41） μg mL^-1] achieved at （3.68 ± 3.14） h, AUC0-LOQ was （4.10± 0.31） mg L^-1 h^-1, and the mean retention time was （14.52 ± 0.02） h. These suggested that two ingredients had slow absorbing speed and high absorbing degree. They could not be eliminated in a short time, thus exerted the topical curative effect.     

八角茴香水提物调控宿主免疫反应抗石斑鱼虹彩病毒的机制研究

【目的】从免疫应答角度探析八角茴香（Illicium verum Hook.f.）水提物（IVE）调控宿主免疫反应而发挥抗石斑鱼虹彩病毒（SGIV）的作用机制,为八角茴香应用于石斑鱼健康养殖产业及开发绿色、健康、高效渔用药物提供理论依据。【方法】通过光学显微镜观察及CCK-8细胞活力测定确定IVE的细胞安全工作浓度,利用实时荧光定量PCR检测IVE对宿主细胞干扰素相关基因（IFN、STAT1、PKR、ISG15、KK_α、STING和IRF3）表达的影响,并以光学显微镜观察和实时荧光定量PCR分析IVE在细胞水平抗SGIV的效果,通过石斑鱼活体试验进一步验证IVE的抗SGIV效果。【结果】IVE细胞水平的安全工作浓度≤0.50 mg/mL; IVE预处理GS细胞2 h可显著（P<0.05,下同）或极显著（P<0.01,下同）激活干扰素相关基因（IFN、STAT1、PKR、IKK_α、IRF3和STING）的表达。SGIV感染GS细胞24和48 h时,经IVE预处理的细胞病变效应（CPEs）明显少于未使用IVE预处理的GS细胞,且细胞内SGIV的MCP基因相对表达量极显著降低,表明IVE可有效抑制SGIV感染;此外,IVE可增强SGIV感染GS细胞中干扰素相关基因的表达,具体表现为IFN、STAT1和IRF3基因在病毒感染后24 h极显著上调,PKR、IKK_α、ISG15和STING基因在病毒感染后24和48 h呈显著或极显著上调趋势。在石斑鱼活体试验中,IVE与SGIV混合腹腔注射后石斑鱼脾脏中SGIV的MCP基因相对表达量在病毒感染后24和48 h均极显著低于仅注射SGIV的石斑鱼。【结论】IVE具有抑制SGIV感染的功能,其作用机制可能是通过诱导干扰素相关基因表达而激活宿主的抗病毒状态,从而发挥间接抗SGIV效果;也说明八角茴香在水产疫病防控中具有研发成渔用抗病功能制剂的潜力。     

噻唑膦对南方根结线虫的作用方式

为探讨噻唑膦对南方根结线虫的作用方式,在室内利用浸渍法测定了噻唑膦对南方根结线虫卵孵化的抑制作用以及对2龄幼虫的致死作用;利用沙柱法测定了对2龄幼虫迁移能力的抑制作用;利用染色法测定了对2龄幼虫侵入番茄能力的影响.结果表明:随着噻唑膦处理浓度的增加与处理时间的延长,线虫卵的孵化抑制率、2龄幼虫的死亡率显著提高,而2龄幼...     

硫对酵母生物富铬过程中铬胁迫的缓解作用

【目的】 探讨酿酒酵母YSI-3.7在富集Cr（Ⅲ）形成葡萄糖耐量因子（GTF）过程中自身抗氧化机制以及硫在该过程中发挥的作用,以期揭示硫对降低铬胁迫,进而提高生物富铬的作用机理。【方法】 以高产GTF酿酒酵母YSI-3.7为目的菌株,通过设置不同浓度的Cr（Ⅲ）、硫组合进行生物富铬,测定不同条件下YSI-3.7菌株的生物富铬量以及相应氧化应激指标（如丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等）的变化,分析硫对酵母菌体在Cr（Ⅲ）胁迫下的改善作用。【结果】 低浓度Cr（Ⅲ）（200 μg?mL ^-1）会刺激酵母YSI-3.7生长,使其生物量增加;而高浓度Cr（Ⅲ）（>500 μg·mL ^-1）对酵母生长有抑制作用。Cr（Ⅲ）浓度为500 μg?mL ^-1时,酵母中有机铬含量为（725.55±55.08）μg?g ^-1 DCW,总铬含量达（1 255.53±43.75）μg?g ^-1 DCW;Cr（Ⅲ）浓度为800 μg?mL ^-1时,有机铬为（536.25±36.89）μg?g ^-1 DCW,其中,总铬含量达（1 812.22±38.24）μg?g ^-1 DCW。随Cr（Ⅲ）浓度的增加（0—800 μg?mL ^-1）,菌体中MDA含量从11.83 nmol?mL ^-1升高到18.04 nmol?mL ^-1。SOD和CAT活力随Cr（Ⅲ）浓度升高而降低。在较低Cr（Ⅲ）浓度（≤500 μg?mL ^-1）下,谷胱甘肽（GSH）、总巯基、总抗氧化能力（T-AOC）含量均升高,但在高浓度Cr（Ⅲ）（800 μg?mL ^-1）下会降低。1 mmol?L ^-1 Na₂SO₃可以缓解Cr（Ⅲ）的胁迫作用,此时,酵母中蛋白质含量上升,MDA含量降低12.83%,CAT活力基本无影响,SOD活力提高4.41%,GSH、T-AOC、GSH-Px含量分别增加28.83%、14.29%和18.80%。【结论】 酵母富铬过程中,Cr（Ⅲ）胁迫作用可造成酵母膜脂过氧化程度加重。在较低铬浓度时（≤500 μg?mL ^-1）,酵母可以通过自身抗氧化酶系统缓解该胁迫作用,其中发挥重要作用的是谷胱甘肽及其相关酶。高浓度Cr（Ⅲ）（800 μg?mL ^-1）下,膜脂过氧化程度进一步加重,酵母自身抗氧化能力不足以抵御Cr（Ⅲ） 胁迫。硫（1 mmol?L ^-1 Na₂SO₃）可以通过提高酵母中SOD活力、GSH、T-AOC、GSH-Px含量,减轻Cr（Ⅲ）造成的膜脂过氧化程度,提高酵母自身抗氧化能力,进而提高酵母生物富铬效率。