板栗叶片DNA的提取及AFLP反应体系的建立

以初展开的板栗嫩叶为材料,利用改进的CTAB法,提取到高质量的板栗叶片总DNA。通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,建立了板栗AFLP银染反应体系,得到了清晰的板栗AFLP指纹图谱。为板栗品种的分子标记和板栗品种间亲缘关系等研究奠定了基础。研究结果表明:①DNA模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应。以初展开的嫩叶提取的板栗叶片总DNA纯度最高,所含蛋白质、小分子杂质少,改良的CTAB提取法可用于板栗AFLP分析,形成清晰的AFLP指纹。②先进行酶切后再进行酶连的反应体系比酶切酶连一起进行的体系效果更好。板栗基因组DNA最佳酶切反应体系为:模板DNA总量500ng,反应体积为25μl,10×Y+/TanqoTMBuffer2.5μl,BSA0.8μl,EcoRI5U,MseI5U。连接反应体系中T4DNA连接酶浓度2U即达最佳效果。酶切、酶连反应最佳温度均为37℃。③以板栗为材料进行AFLP标记时,E AAC+M CAA、E AAC+M CAT和E AGT+M CAT三个引物均获得较好的多态性。其中以E AGT+M CAT引物组合的扩增条带信号强度一致性好,条带分布均匀,能够得到稳定、清晰、分辨率较高的指纹谱带,可进行中国板栗的遗传变异分析。     

梅花基因组AFLP银染反应体系的建立和优化

采用改进的SDS DNA提取方法从梅花的嫩叶和老叶中提取获得总DNA .所得DNA样品的OD2 6 0 OD2 80 值在1 7～ 1 9之间 ,琼脂糖凝胶上主带清晰、较少降解、样品纯度高、蛋白去除干净且得率高 .该体系对原提取程序作了多处简化 ,使操作简便、快捷、高效 ,适合于梅花DNA提取 ,所提取的DNA样品不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂 ,可被限制性内切酶MseⅠ和EcoRⅠ完全酶切 ,适合AFLP PCR反应应用 ,得到清晰的指纹式样 .     

牡丹基因组AFLP银染反应体系的建立和优化

采用改进的SDS方法,从牡丹成熟叶片中提取基因组DNA,所得DNA样品的A260/A280值在1.7～1.8之间,琼脂糖凝胶电泳主带清晰、DNA纯度高、较少降解、不含酶反应抑制剂,可被MseⅠ和PstⅠ两种限制性内切酶完全酶切.通过酶切连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验过程,成功建立了牡丹品种AFLP银染反应体系,得到了清晰的指纹图谱.对扩增结果进行聚类分析,得到了23个牡丹品种的聚类分析图.     

紫薇叶片DNA的提取及AFLP反应体系的建立

以紫薇叶片为材料,利用改进的酚一氯仿法,提取到了高质量的紫薇叶片DNA,并建立了20个紫薇品种和南紫薇的AFLP银染反应体系,首次在紫薇DNA提取、酶切连接、预扩增、选择性扩增等实验过程取得了成功,得到了清晰的紫薇品种的AFLP指纹图谱,为紫薇基因库的建立、优良品种选育以及亲缘关系的系列研究奠定了理论基础．     

堇菜属植物AFLP反应体系的建立

以堇菜属17种植物为试材,建立了适合堇菜属植物研究的AFLP反应体系.采用改良的SDS法提取堇菜属植物总DNA,对堇菜AFLP银染反应体系进行优化.在提取液中加人β-巯基乙醇,PVP可有效去除酚类等物质,以满足AFLP分析标记对基因组DNA的纯度高、完整性好的要求.37℃下酶切6h可以将基因组DNA完全切开,预扩增产物稀释35倍作为选择性扩增模板效果好,扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,通过银染,能得到清晰的指纹式样.     

青阳参叶片DNA的提取与AFLP反应体系的建立

以青阳参叶片12个样品为材料,利用改良的CTAB法,提取得到高质量的青阳参DNA,通过对AFLP分析过程中DNA的提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、电泳和银染等诸多因素进行优化、分析,建立了一套适合青阳参的AFLP技术优化体系,得到了清晰的青阳参AFLP指纹图谱,为青阳参基因库的建立、遗传多样性研究等奠定了理论基础。     

芒果AFLP分子标记体系的建立

[目的]构建我国芒果主要栽培品种的AFLP分子标记体系。[方法]供试31个芒果品种为：Banganapalli、台农1号、桂热10号、Carabao、Nang Klang wun、泰国506、紫花、Keitt、粤西1号、斯里兰卡811、龙井大芒、红象牙、小菲、泰国504、Spooner、R2E2、串芒、鹦鹉芒、Irwin、金煌、Kent、海豹、Haden、Dashehari、Neelum、桂香、Ono、白象牙、Bambaroo、Macheso、Zill。以粤西1号芒果幼嫩叶片为材料探索提取高质量DNA的方法,为了获得更高质量和数量的基因组DNA,对曾杰的方法进行了下列改良：A、用2％的CTAB提取液,其他不变;B、用3％的CTAB提取液,但在提取后只用氯仿异戊醇提取2次;C、用3％的CTAB提取液,但在提取后用氯仿异戊醇提取1次;D、用3％的CTAB提取液,但在提取后用酚氯仿异戊醇提取1次。用供试品种中的台农1号、Carabao、Keitt、Kent对64对引物组合进行筛选,其中8个EcoRI引物分别是E—AAC、E—AAG、E—ACA、E—ACT、E—ACC、E—ACG、E—AGC、E;AGG,8个MseI引物分别是M-CAA、M-CAC、M-CAG、M-CAT、M—CTA、M-CTC、M-CTG、M-CTT。利用AFLP分子标记在DNA水平上对芒果进行遗传多样性研究。[结果]4种方法提取的DNA较完整,均可得到明亮清晰的主带。且综合比较,用B方法（即采用较高浓度的提取液,提取后用氯仿异戊醇提取2次）可获得高质量、高纯度DNA,可用于芒果AFLP标记分析。供试64对引物组合中适用于芒果种质资源AFLP分析的引物组合共14对,分别是E—ACC／M-CAC、E—AAC／M-CAT、E—AAG／M-CAC、E-AAG／MoCAT、E—ACA／M-CAC、E—ACA／M-CAG、E—ACA／M-CAT、E—ACA／M-CTA、E．ACT／M-CAC、E—ACC／M—CTC、E—ACC／M—CTG、E-AG＆M-CAG、E．AGC／M—CTA、E—AGC/M-CTC。这14对引物组合在31份芒果种质中共扩增出1761条带,其中多样性带比例为97％。平均每对引物产生125．8条带和121．6条多样性带。14对引物均可将上述31个品种完全区别开来,其中E—ACA／M-CAT和E-AGC／M-CTC引物组合多态性最大,达100％,可用于芒果品种指纹图谱构建。[结论]利用AFLP可以高效检测芒果种质资源分子标记多样性。     

玫瑰基因组AFLP反应体系的建立和优化

以玫瑰(Rosa rugosa)叶片为材料,利用改良的CTAB法,提取到了高质量的玫瑰叶片DNA,并建立了37个玫瑰品种和5个蔷薇品种的AFLP银染反应体系,首次在玫瑰DNA提取、酶切连接、预扩增、选择性扩增等实验过程取得了成功,得到了清晰的玫瑰品种的AFLP指纹图谱,为玫瑰基因库的建立、优良品种选育以及亲缘关系的系列研究奠定了理论基础.     

节瓜基因组AFLP体系建立的研究

以节瓜雌性系K36和强雄系G为材料,从DNA提取、酶切连接、预扩和选扩等方面进行选择优化,建立高效稳定的AFLP分析体系,同时从64对AFLP引物组合筛选出多态性好的引物组合6对,并以该体系开展节瓜雌性性状分子标记和图谱构建等遗传分析研究。     

悬铃木AFLP分子标记技术体系的建立

采用改进的CTAB方法,从悬铃木叶片中提取基因组DNA,所得DNA样品的A260/A280值为1.7～1.9,琼脂糖凝胶电泳主带清晰、DNA纯度高、较少降解、不含酶反应抑制剂,可被MseⅠ和PstⅠ两种限制性内切酶完全酶切,从20对引物中筛选出6对带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物,分别为: M74P50,M89P57,M74P26,M36P16,M80P66,M23P66.通过酶切连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验过程,成功建立了悬铃木AP反应体系,得到了清晰的指纹图谱,试验结果重复性好.     

板栗高效组培体系的建立和优化

为了建立和优化‘燕山红栗’组培快繁体系,以种子为材料,在种子萌发后,取带腋芽茎段作为外植体,通过正交试验和单因素随机区组实验筛选快繁体系最适宜的培养条件。实验结果表明:最适宜种子萌发的基础培养基为WPM,最适茎段初代诱导培养基为WPM+1.0mg/L ZT+0.15mg/L NAA,诱导率达到90.56%;最佳增殖培养基为WPM+1.5mg/L ZT+0.15mg/L NAA,增殖系数可达到3.32;将试管苗基部于2mg/L IBA中浸泡4min后接入WPM基础培养基得到最大生根率,为55.33%。     

板栗低产园改造技术研究

实生繁殖、经营管理粗放是造成板栗产量低、品质差的重要因素．通过采取良种高接换冠，结合树体修剪、抚育施肥、栗粮间作、病虫害防治等综合技术措施，对10～12年生低产栗园实施改造，产量由改造前的108.6kg／hm^2提高到1260.45kg／hm^2；2年生幼树经过嫁接改造提早2～3a结实．     

中国板栗授粉特性初步研究

通过两年对板栗授粉特性的试验研究,发现虫媒授粉在板栗授粉过程中有着重要的地位,与对照样株自然授粉相比,隔离虫媒授粉的处理样株,柱头上的平均花粉数量减少32%～50%,平均球苞重减少22%～35%,空苞率高19%～23%,平均每总苞内坚果数少0.58～1.14个.     

板栗结实特性研究

研究并探讨了部分板栗良种间的授粉结实特性以及不同亲本对板栗结实率、空苞率等的影响。人工授粉杂交结果表明,不同品种间杂交,座苞率、落苞率有较大差异,结实率、空苞率、坚果数/结实苞在不同杂交组合间也存在明显差异,‘红栗×河北短丰’结实率最高,空苞率较低,其次为‘雄花败育×河北短丰’以及‘沂蒙短枝×河北短丰’,‘垂枝栗×河北短丰’和‘红栗×垂枝栗’结实率最低,空苞率却最高。同一父(母)本不同母(父)本间由于亲和性不同也使杂交结果差异较大,以‘河北短丰’为父本的四个杂交组合和以‘红栗’为母本的两个杂交组合中,母(父)本不同,结实率、空苞率乃至坚果数/结实苞均存在显著差异。研究还发现板栗总苞的生长发育和其内部是否有坚果关系不大。根据试验结果,板栗父母本间亲和性好,则空苞率低,结实率高,因而亲和性好的授粉树的选择在实际生产中具有重要意义。     

板栗胚珠培养研究初报

以板栗胚珠为外植体,筛选了板栗胚珠培养适宜的外植体采摘时期、生长调节剂组合、培养基中碳源种类、培养基中糖浓度等指标,并深入探讨了板栗胚珠培养中存在的急需解决的技术问题,为板栗体细胞胚胎高频发生体系的建立奠定了基础结果表明: ①在板栗胚珠离体培养中,适宜的外植体采摘时间为板栗第1次盛花期后的30～44 d;②单独使用0.5或1.0 mg/L的2,4-D、6-BA、TDZ均不能诱导板栗胚珠的体细胞胚胎发生;③不同种类的细胞分裂素与2,4-D配合使用时,其种类和浓度直接影响出胚率,6-BA与2,4-D配合使用的效果明显优于KT、TDZ、ZT分别与2,4-D的组合,6.0 mg/L的2,4 D和0.5 mg/L的6-BA配合使用,有利于诱导胚珠的体细胞胚胎发生;④板栗胚珠培养中,胚性愈伤组织的发生与2,4-D浓度、细胞分裂素种类、细胞分裂素浓度都显著相关,4.0 mg/L的2,4-D和1.0 mg/L的TDZ 配合使用,利于诱导胚性愈伤组织的发生;⑤使用白砂糖作为培养基中的碳源最好,其效果明显优于蔗糖、葡萄糖、麦芽糖;⑥培养基中白砂糖浓度为10～40 g/L时,都能诱导板栗胚珠的体细胞胚胎发生,但外植体死亡率呈现出随糖浓度增加而升高的趋势.      

板栗支链淀粉含量的双波长测定方法

研究了双波长分光光度法测定板果果仁直链淀粉和支链淀粉的含量。对光度测定的最佳条件和样品前处理进行了详细考察。选择支链淀粉的测定波长为550nm和695nm,直链淀粉的测定波长为615nm和475nm。样品测定时应进行脱脂脱糖处理,直链淀粉浓度在5～60μg／mL、支链淀粉浓度在5～140μg／mL时准确度和精密度均较好。     

板栗叶片性状表型多样性研究

对中国板栗自然分布区8个产地采集的板栗叶片进行取样测定,分别测定叶片3项形态指标,结果表明,各指标在同一群体不同品种间差异显著。板栗叶片形态在群体间和群体内存在广泛差异,其中,叶片长、叶片宽及叶片长宽比等3个性状群体内的差异均达极显著水平,F值分别为7.50、6.36及7.39;群体间,叶片长、叶片宽及叶片长宽比3个性状差异均达极显著水平,其F值分别为19.36、18.32和3.40。根据3个性状的平均,群体间的方差分量占总变异的11.417%,群体内的占39.86%,机误占48.72%。板栗叶片3个性状群体间的表型分化系数平均为13.03%,而群体内的平均表型变异占86.97%,表明群体内变异是板栗叶片表型变异的主要来源。     

板栗分子标记辅助育种的配套育苗技术研究

[目的]研究板栗分子标记辅助育种的配套育苗技术,以期节约分子标记辅助育种苗木培育成本、缩短育种年限。[方法]按照板栗的横径和纵径,采取1/2、1/3、1/4等不同的切取比例以及横切、竖切、斜切、双边竖切等不同的切取方法,共计10个处理。测定各处理的发芽率、成活率及苗木形态指标,分析各处理与对照之间的显著性差异。[结果]1/3斜切为最佳切取方式,不仅可以保证高发芽率、成活率,且经其处理后的幼苗生长状况与对照的板栗幼苗无明显差异,苗木质量较高。[结论]该套育苗技术,不仅可以节约育苗成本,缩短育种年限,还可促进板栗提前发芽,对生产有一定的指导意义。     

罗田县板栗产业生产调查

罗田县板栗栽培面积从1985年的0.44万hm2发展到2006年的6.13万hm2,年产量从1985年的0.32万t上升到2006年的3.5万t,面积和产量均居全国县(市)之首,发展势头十分喜人,但同时又出现了许多问题.作者通过实地调研后,简要分析了罗田板栗产业的生产现状,着重调查了产业的主要问题及原因,并提出了解决对策,可为罗田板栗产业可持续地健康发展提供有益的参考.