稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选

利用农杆菌T-DNA介导的遗传转化体系转化稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)Y34菌株,平均每转化1.0×106个稻瘟病菌分生孢子可得到约300个抗潮霉素菌株。用该转化体系转化和筛选,获得抗潮霉素菌株6855个。PCR检测结果表明,所有表现抗潮霉素菌株均含抗潮霉素基因,说明抗潮霉素特性是T-DNA携带潮霉素基因插入Y34基因组的表型效应,即抗潮霉素菌株是T-DNA插入突变体。对56个突变体DNASouthern检测结果表明,有27个突变体是单拷贝插入,突变体T-DNA插入拷贝数平均为1.43。随机取1600个突变体进行致病力测定,结果发现23个突变体完全丧失致病能力。     

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。     

我国第一个水稻T—DNA插入突变体库在中国水稻研究所建成

由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理生态研究所合作完成的“水稻Ｔ-ＤＮＡ插入突变体库的构建和研究”成果 ,于２００２年１２月２３日通过了由浙江省科技厅主持、以中国水稻基因组学著名专家李家洋院士和韩斌博士为主任委员的鉴定委员会的成果鉴定。鉴定委员会认为该项成果已达到国内领先水平 ,部分成果达到了国际水平。通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系 ,将玉米转座子Ａｃ／Ｄｓ等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织 ,获得了１．２万余个独立的Ｔ -ＤＮＡ插入株系 ,并构建…     

稻瘟病菌突变体 Y34- 0453 的表型分析和 T- DNA 插入位点的定位

对稻瘟病菌 T- DNA 插入突变体 Y34- 0453 的表型分析,发现其菌落黄化,气生菌丝减少,产孢量增加,不能侵染正常的感病水稻品种,但可以侵染具有微伤口的水稻叶片,分生孢子接种洋葱皮没有形成侵染钉。初步认为是该突变体附着胞不能正常分化,从而不能正常产生侵染钉致使致病力丧失。通过 DW- ACP-PCR,获得了 T- DNA 插入的侧翼序列。测序并进行比对的结果表明,T- DNA 插入在Ⅱ号染色体的 5.184 超级重叠群（Supercontig5.184）中的未知蛋白编码基因（MGG 02065.5）下游 1 773 bp 处,T- DNA 插入位点处可能有个远程调控元件。     

胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析

利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杞果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4 680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传.随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2 kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起:进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入.     

水稻T DNA插入雄配子不育突变体的创建

 对6000多个转基因T DNA插入水稻株系进行异常遗传分离分析（选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因hpt）,发现216个转基因株系的T DNA呈现1∶1分离。接着利用测交方法检测T DNA的遗传规律,初步确定其中57 个候选株系为雄配子不育候选突变体。随后对候选突变株进行多代遗传分析及花粉细胞学观察,结果表明其中的38个突变体花粉黑染率约为50％,自交后代T DNA的异常分离是由于转基因植株的花粉半不育所致,T DNA的传递只能通过雌配子体。另外,利用ELISA定量测定突变体中cry1Ac(Bt)基因编码蛋白的表达量,发现花粉的这种不育性与外源基因的表达量之间没有直接关系,推测这38个雄配子突变体败育的原因主要是T DNA插入引起内源基因变异。TAIL PCR 获得了22个水稻雄配子不育T DNA 插入突变体的侧翼序列,通过BLAST检索,定位了15个不同的插入位点,其中12个插入位点位于基因区或基因调控区。     

甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位

由镰孢菌复合种引起的甘蔗梢腐病（pokkah boeng disease, PBD）是甘蔗的主要病害之一。在广西,甘蔗镰孢菌（Fusarium sacchari）是PBD的优势病原菌。尽管PBD的研究已有较长的历史,但甘蔗镰孢菌的致病分子机理远未得到阐明。为研究甘蔗镰孢菌的致病分子机理,本研究采用农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）技术构建甘蔗镰孢菌FF001菌株的T-DNA插入突变体库。采用携带潮霉素B磷酸转移酶基因pTHR1-AH双元载体的农杆菌菌株AGL-1介导转化F. sacchari分生孢子,获得3018个转化子;随机选取12个转化子进行PCR检测和Southern杂交分析,结果显示所有检测突变株均插入潮霉素B磷酸转移酶基因,多数为单拷贝插入。采用离体叶片接种评价转化子的致病力,获得致病力明显减弱21个和致病力增强9个,共30个突变体。通过TAIL-PCR扩增测序并与甘蔗镰孢菌基因组序列比对,确定了其中27个突变株的T-DNA插入位点。观察到多个插入位点伴随有基因组片段缺失,导致1...     

稻瘟病菌温度敏感型突变体的筛选

通过紫外诱变,筛选获得了274个稻瘟病菌的温度敏感型突变体,这些突变体在25℃下可以生长,而在33℃下不能生长。致病性测定结果表明,有32个突变体的致病性显著降低; 在33℃条件下,不萌发的有7个;有12个萌发后停止生长,不能形成附着胞;有9个可以形成附着胞,以后停止生长;有4个形成膨大透明且成串生长的附着胞,随后停止生长。有些温度敏感型突变体形成子囊壳的能力也发生了改变。     

稻瘟病菌大片段DNA转化载体的构建

构建能够转化大片段DNA的载体是进行基因簇功能分析的重要手段。利用cosmid载体和pBHt2载体构建了一个可以在稻瘟病菌中转化大片段DNA的载体,通过农杆菌介导的转化方法,成功地将超过30kb的大片段DNA转化到稻瘟病菌中。研究结果将促进稻瘟病菌基因簇的功能分析。     

Recovery and Biological Properties of Nitrate Non-utilizing Mutants of Rice Blast, Magnaporthe grisea

Eleven nitrate non-utilizing (nit) mutants were recovered from six isolates of Magnaporthe grisea cultured on MM media amended with 60 g/L potassium chlorate, with a frequency of 1.42 %. Some biological properties, such as growth rate, growth biomass, cultural characters, conidial production, sexual reproduction ability, and pathogenicity were compared between nit mutants and their parent isolates. Results showed that all the nit mutants were resistant to chlorate. Some important biological properties such as the growth rate on YPSA, conidial production ability on TPSA, pathogenicity, had no significant differences between nit mutants and their parent isolates. Mating type didn‘t change, but perithecia production ability of fertile isolates changed significantly as compared with that of their parent isolates. Therefore, the nit can be used as a genetic marker to study the genetics such as pathogenicity, fungicide resistance in Magnaporthe grisea.     

稻瘟病菌nit突变体的诱导及其生物学性状

将6个稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）菌株分别在含60 g/L氯酸钾的MM培养基上培养40 d后,共得到11个硝酸盐利用缺陷突变体（Nitrate nonutilizing mutants,简称nit突变体）,频率为1.42 %。比较了各nit突变体与亲本之间在无性和有性阶段的主要生物学性状,结果表明,所有的nit突变体均对氯酸钾产生了抗性。在YPSA平板上的生长速率、在TPSA平板上的产孢量和致病能力等重要的生物学性状都与亲本没有显著差异,交配型没有发生改变,但可交配菌株产子囊壳的能力与亲本有显著差异。因此,可以用nit作为遗传标记研究稻瘟病菌有关性状的遗传学。     

Recovery and Biological Properties of Nitrate Non-utilizing Mutants of Rice Blast, Magnaporthe grisea

Eleven nitrate non-utilizing (nit) mutants were recovered from six isolates of Magnaporthe grisea cultured on MM media -amended with 60 g/L potassium chlorate, with a frequency of 1.42 %. Some biological properties, such as growth rate, growth biomass, cultural characters, conidial production, sexual reproduction ability, and pathogenicity were compared between nit mutants and their parent isolates. Results showed that all the nit mutants were resistant to chlorate. Some important biological properties such as the growth rate on YPSA, conidial production ability on TPSA, pathogenicity, had no significant differences between nit mutants and their parent isolates. Mating type didn't change, but perithecia production ability of fertile isolates changed significantly as compared with that of their parent isolates. Therefore, the nit can be used as a genetic marker to study the genetics such as pathogenicity, fungicide resistance in Magnaporthe grisea.     

Isolation of Gene Mutation from a Pathogenicity-Enhanced Mutant of Magnaporthe oryzae

To find new genes involved in fungal pathogenicity,a mutant(B11)exhibiting enhanced pathogenicity was isolated from an Agrobacterium-mediated transformed Magnaporthe oryzae mutant library.Southern blotting analysis showed that T-DNA insertion in the B11 genome was a single copy.TAIL-PCR and sequence alignment analyses revealed that a putative gene locus MG01679 was interrupted by the T-DNA fragment.By using the PCR-based method,the DNA and cDNA of the mutant gene MG01679 was cloned and sequenced.The open re...     

稻瘟病菌对异稻瘟净、多菌灵和三环唑的敏感性检测及抗药性变异研究

用区分剂量法检测了2000年采自中国广东、广西、安徽和江苏四省129株稻瘟病菌对异稻瘟净和多菌灵的抗药性频率。稻瘟病菌对生产上已停用10年左右的异稻瘟净的抗药性频率仍高达79.1%;在广东省高要市检测到了一例多菌灵抗药性菌株GY5,频率为0.78%。利用抑制菌丝黑色素化的最小抑制浓度（MIC）离体检测了稻瘟病菌对三环唑的敏感性,结果表明稻瘟病菌黑色素的生物合成对三环唑存在着不同的敏感性基因水平,但没有观察到上述MIC值与活体条件下测定的防治稻瘟病的[i]EC[/i][sub]50[/sub]间存在相关性。用药剂驯化和紫外诱变的方法都获得了稻瘟病菌抗异稻瘟净突变体和抗多菌灵突变体,但未能获得抗三环唑突变体。