转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

利用密码子优化提高Bt cry1Ah基因在转基因玉米(Zea mays L.)中的表达

Bt cry1Ah基因是本实验室从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BT8中克隆的一种新型杀虫蛋白基因。在前期工作中已根据植物密码子偏好性对cry1Ah基因进行过一次优化。根据玉米密码子偏好性对cry1Ah基因进行第二次优化,并将两次优化的cry1Ah基因分别构建了pAhmG和pmAhb植物表达载体,利用农杆菌介导法转化玉米自交系综31,分别得到10株和9株阳性转基因玉米植株。通过ELISA、Western blot检测及生物活性检测,比较不同优化的基因在玉米中的蛋白表达量及抗虫情况。初步结果表明外源基因在玉米植株中可以稳定表达并可以遗传。二次优化基因比一次优化基因在玉米中的蛋白表达量更高,抗虫性更好。表明密码子优化有利于提高外源基因的表达。     

农杆菌介导的Bt cry1Ⅰa基因转化花椰菜的研究

利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry1Ⅰa基因构建了双T DNA边界的植物表达载体pCS1Ⅰa-LR,以瑞士雪球花椰菜具柄子叶和下胚轴为外植体,通过农杆菌介导法将cry1Ⅰa基因导入花椰菜中,共获得30株转化植株,经PCR检测,其中18株为PCR阳性植株,PCR阳性率为60%;RT-PCR和Western杂交检测结果表明,cry1Ⅰa基因在转基因花椰菜中可以正常转录和正确表达。转基因植株用小菜蛾幼虫进行饲虫试验,结果表明,转cry1Ⅰa基因花椰菜对小菜蛾具有很强的毒杀作用,昆虫幼虫的校正死亡率高达100%。获得的转基因花椰菜可用于下一步的抗虫花椰菜的培育。     

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT PCR、Western 杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03 μg/g 鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。     

玉米胚性愈伤组织的遗传转化及耐草甘膦植株再生

以优良玉米自交系X2211的幼胚胚性愈伤组织为受体材料,采用农杆菌介导法将来自微生物荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)G2菌株的抗除草剂基因2mG2-epsps转入玉米愈伤组织细胞,转化后的细胞经草甘膦筛选,获得抗性愈伤组织并再生植株282株,成活86株,经特异PCR检测表明其中26株植株转入了2mG2-epsps基因,喷施0.125%除草剂试验检测表明,转基因植株具有良好的耐除草剂特性,为抗除草剂玉米新品种选育提供了较好的亲本材料。     

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L.）NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。     

农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究

 【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦（Bialaphos）梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng•g-1叶片鲜重（FW）,最低的仅为1.93 ng•g-1叶片鲜重（FW）,平均为87.50 ng•g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。     

利用花粉管通道法将耐草甘膦基因mG2-epsps 导入玉米自交系的研究初报

构建了含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表达载体pUmG2,采用花粉管通道法将其导入优良玉米自交系X90中,对Tn代1542株植株进行草甘膦喷洒实验,共得到32株能够耐受0．25％草甘膦药液的抗性植株;对这32株抗性植株的PCR检测结果表明,其中29株为PCR阳性植株,平均转化率为1．88％;Southern杂交和Western杂交检测结果证明mG2-epspps基因已整合至玉米基因组并正确表达。     

cry1Ia1基因转化大豆及抗虫性的初步评价

cry1Ia1基因编码的是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)的杀虫晶体蛋白(ICPs),产物对鳞翅目(Lepidoptera)和鞘翅目(Coleoptera)昆虫具有毒害作用,可防治大豆食心虫等害虫.利用农杆菌介导的方法将cry1Ia1基因转入大豆栽培品种黑农35中,并获得了5株转cry1Ia1基因的株系.PCR、Southem blotting和RT-PCR检测结果表明cry1Ia1基因已经整合到大豆基因组中并稳定表达.通过人工接种的方法对转基因植株抗大豆食心虫的水平进行了初步的评价,结果表明其中的2株对大豆食心虫具有高度的抗性,2株具有中等程度的抗性,1株与对照无明显差异.cry1Ia1基因首次成功导入大豆栽培品种黑农35中并获得抗大豆食心虫的转基因植株.     

农杆菌介导甜高梁转Bt cry1Ah的研究

[目的]建立一套高效、稳定的甜高梁农杆菌遗传转化体系,并在甜高梁中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性.[方法]以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高梁品种"BABUSH"和"MN-3025"中.对获得的再生植株进行 PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析.[结果]对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦(Bialaphos)梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%.RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T.甜高梁转基因植株中能够正常转录.Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69ng·g-1叶片鲜重(FW),最低的仅为1.93 ng·g,-1叶片鲜重(FW),平均为87.50 ng·g-1FW.饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)表现为抗性.[结论]利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究.     

Developing transgenic maize(Zea mays L.) with insect resistance and glyphosate tolerance by fusion gene transformation

Using linker peptide LP4/2A for multiple gene transformation is considered to be an effective method to stack or pyramid several traits in plants. Bacillus thuringiensis(Bt) cry gene and epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) gene are two important genes for culturing pest-resistant and glyphosate-tolerant crops. We used linker peptide LP4/2A to connect the Bt cry1 Ah gene with the 2m G2-epsps gene and combined the wide-used man A gene as a selective marker to construct one coordinated expression vector called p2 EPUHLAGN. The expression vector was transferred into maize by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, and 60 plants were obtained, 40% of which were positive transformants. Molecular detection demonstrated that the two genes in the fusion vector were expressed simultaneously and spliced correctly in translation processing; meanwhile bioassay detection proved the transgenic maize had preferable pest resistance and glyphosate tolerance. Therefore, linker peptide LP4/2A provided a simple and reliable strategy for producing gene stacking in maize and the result showed that the fusion gene transformation system of LP4/2A was feasible in monocot plants.     

cry2Ah-M基因杀虫活性研究

转Bt基因抗虫棉经过20多年的研究和生产应用,虽然取得了巨大的生态和经济效益,但棉铃虫的抗性风险也逐渐增加,因此,通过发掘不同杀虫机理的Bt基因,不仅可以提高杀虫效率,而且有效的避免或延迟昆虫的抗性。依据棉花遗传密码子偏好性,对来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)新型Bt基因cry2Ah-like进行了密码子优化改造,利用农杆菌介导法导入烟草。通过荧光定量PCR方法,Southern blot和Western blot方法,证明了转基因烟草中外源基因在RNA和蛋白水平上均稳定表达,并且已整合到烟草基因组中。生物活性检测结果表明,饲喂转基因烟草叶片4 d后,棉铃虫幼虫校正死亡率达86.59%,达到高抗水平,进一步证明密码子优化后的cry2Ah-M基因能够高效表达且具有较高的杀虫活性,是有效防治棉铃虫的新型基因。     

转cry1Ab基因抗虫水稻的培育

采用农杆菌介导的遗传转化法,将cry1Ab基因导入优良三系恢复系明恢63,共获得了92个独立转化株,其中13株为单拷贝。通过发芽试验,获得了11个单拷贝转基因纯合系。ELISA检测结果表明:不同株系其Bt蛋白含量不一样,但杂种的Bt蛋白含量与其亲本一致。室内人工接虫试验及田间抗虫性试验初步表明:5个纯合株系表现高度抗性,且农艺性状与原品种没有显著差异。由此说明,所获得的这些单拷贝转基因株系可作为育种材料,用于抗虫水稻的培育。     

Acquisition of Insect-Resistant Transgenic Maize Harboring a Truncated cry1Ah Gene via Agrobacterium-Mediated Transformation

A novel insecticidal gene cry1Ah was cloned from Bacillus thuringiensis isolate BT8 previously for plant genetic engineering improvement. Truncated active Cry1Ah toxin has a toxicity level similar to that of the full-length Cry1Ah toxin. In this study, plant expression vector pMhGM harboring truncated cry1Ah gene was transformed into maize (Zea mays L.) immature embryos by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation at which maize alcohol dehydrogenase matrix attachment regions (madMARs) were incorporated on both sides of the gene expression cassette to improve gene expression. A total of 23 PCR positive events were obtained with a transformation efficiency of 5% around. Bioassay results showed that events 1-4 and 1-5 exhibited enhanced resistance to the Asian corn borer (Ostrinia furnacalis). These two events were further confirmed by molecular analysis. Southern blot suggested that a single copy of the cry1Ah gene was successfully integrated into the maize genome. Western blot and ELISA showed that the foreign gene cry1Ah was expressed stably at high level in maize and could be inherited stably over generations. The results of a bioassay of T1-T4 transgenic maize plants indicated that the transgenic plants were highly toxic to the Asian corn borer and their resistance could be inherited stably from generation to generation. Thus, events 1-4 and 1-5 are good candidates for the breeding of insect-resistant maize.     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia17基因克隆、表达的研究

根据cry1I类基因的全长序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BtMX2的总DNA为模板扩增出片段长为2.1 kb的cry1I的全长基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达栽体pEB,转化大肠杆菌Rosetta茵株,诱导表达出81 ku的蛋白,编码的...