ToMV外壳蛋白互作IP-L蛋白的亚细胞定位及表达分析

【目的】前期研究显示To MV外壳蛋白(coat protein,CP)可以与烟草蛋白L(CP-interacting protein-L,IP-L)相互作用,本研究旨在明确To MV CP与IP-L的共定位情况、IP-L的组织表达和在To MV侵染条件下烟草IP-L及其编码蛋白的表达变化情况,为进一步明确IP-L的功能提供依据。【方法】通过双酶切法从笔者实验室构建保存的p GBKT7-CP和p GADT7-IP-L重组载体上切下To MV CP和IP-L目的片段,构建融合蛋白植物表达载体p PZP-IP-L-N-EGFP和p PZP-CP-N-Ds Red及原核表达载体p EGX-IP-L。通过热激法将融合表达的植物表达载体转化至农杆菌EHA105,在烟草表皮细胞瞬时表达IP-L-N-EGFP和CP-N-Ds Red,共聚焦荧光显微镜下观察IP-L和To MV CP共定位情况。用实时荧光定量RT-PCR(q RT-PCR)分析IP-L在本氏烟各组织部位的表达量。原核表达载体p EGX-IP-L,转化原核表达菌BL21,优化GST-IP-L可溶性表达条件后大量表达该蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-IP-L蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法明确抗体的特异性后,利用该抗体分析To MV侵染条件下番茄IP-L蛋白表达情况,用q RT-PCR检测IP-L表达变化与蛋白水平是否一致。【结果】To MV CP在本氏烟叶片表皮细胞的细胞质和细胞质膜以及叶绿体均有分布,而IP-L只在本氏烟叶片表皮细胞质膜表达,二者共定位在细胞质膜。IP-L在本氏烟叶片中特异高表达,显著高于茎、根和花中的相对表达量。在温度为30℃,IPTG诱导浓度为0.3 mmol·L-1条件下表达出大小为42.8 k D的可溶性GST-IP-L融合蛋白。纯化获得约4.2 mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与IP-L的原核产物特异性结合。在To MV侵染本氏烟1、3、7 d后,Western印迹分析表明IP-L在叶片内表达量随接种时间呈明显上调趋势。q RT-PCR检测结果与Western印迹结果一致,显示IP-L在To MV侵染本氏烟第7天后的叶片内表达量是健康对照的3倍多,差异达到显著水平。【结论】To MV CP和IP-L共定位于本氏烟表皮细胞质膜,IP-L在本氏烟叶片内特异高表达。制备的IP-L多克隆抗体具有良好的免疫反应活性,可以用于IP-L表达量检测;To MV侵染烟草可诱导IP-L及其编码蛋白表达量显著上调。     

火龙果HuABAR的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

在前期利用SSH筛选到抗旱相关基因HuABAR的Unigene序列的基础上,进行了HuABAR的全长cDNA克隆、生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明:HuABAR基因cDNA全长为1 239bp,5′-UTR为264bp,3′-UTR为414bp,完整开放阅读框(ORF)共561bp,编码187个氨基酸;生物信息学分析显示,HuABAR基因编码蛋白具有典型的SRPBCC结构域,并与PYR1/PYLs(pyrabactin resistance 1/PYR1like)家族具有较高的相似性;HuABAR在干旱、高温(42℃)和低温(4℃)等逆境胁迫下显著上调表达,并在干旱胁迫5d、高温3d时表达量最高,低温处理5d内,表达量持续上升;通过PEG介导法瞬时转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,发现该基因定位于细胞质,与已报道的其他PYR1/PYLs家族基因一致。因此,HuABAR基因可能在火龙果干旱胁迫应答中发挥重要作用。     

甘蔗新基因ShUGT2的生物信息学分析及亚细胞定位

UDP-糖基转移酶在植物体内负责糖基化修饰,对植物的生长发育起着关键作用.以甘蔗品种ROC22为供试材料,提取成熟叶片总RNA并反转录合成cDNA,经PCR扩增获得ShUGT2基因cDNA全长序列,对其进行生物信息学、亚细胞定位和组织特异性表达分析.结果表明:ShUGT2含有1782 bp的完整开放阅读框,编码593个...     

薄壳山核桃CiSPL2基因克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】克隆薄壳山核桃SQUAMOSA启动子结合蛋白（SPL）转录因子基因CiSPL2,并对其进行亚细胞定位及表达分析,为探究该基因在薄壳山核桃雌花发育过程的分子机制提供理论依据。【方法】根据薄壳山核桃基因组数据,采用RT-PCR方法克隆CiSPL2基因编码区（CDS）序列,利用生物信息学软件分析其序列特征和蛋白理化性质,构建pCAMBIA1300-CiSPL2-GFP融合表达载体,瞬时转化烟草后观察荧光信号确定亚细胞定位情况。基于转录组数据和实时荧光定量PCR检测CiSPL2基因在不同组织及不同雌花芽分化时期的表达模式。【结果】薄壳山核桃CiSPL2基因CDS长度为1398 bp,共编码465个氨基酸残基,相对分子量为51.78 kD,理论等电点（p I）为8.28,不稳定系数为49.89,脂肪酸氨基酸指数为64.62,平均亲水性平均值（GRAVY）为-0.617,为不稳定的亲水性蛋白,含有SBP结构域（位于第183～257位氨基酸）,亚细胞定位于细胞核。CiSPL2蛋白的二级结构主要由α-螺旋（17.42%）、延伸链（13.55%）、β-转角（1.72%）和无规则卷曲（67.31%...     

拟南芥AGO2的亚细胞定位分析

Argonaute(AGO)是一类高度保守的蛋白,对基因沉默和植物抗病性起重要调控作用。为进一步了解AGO作用机制,今采用生物信息学技术对拟南芥AGO蛋白各成员的细胞定位进行预测,并对AtAGO2进行亚细胞定位分析。10个拟南芥AGO蛋白均不含信号肽序列,表明它们不是外泌蛋白。AtAGO1,AtAGO2,AtAGO3,AtAGO4和AtAGO9带有核定位信号,但携带的核定位信号肽序列各不相同,显示这些AGO蛋白可能定位于细胞核。通过克隆AtAGO2全长序列,构建获得与报告基因eGFP融合表达的细胞定位检测载体pCHF3-eGFP∷AtAGO2,采用农杆菌介导的方法将其瞬时表达于本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中,激光共聚焦显微镜观察结果表明,AtAGO2蛋白定位于细胞质和细胞核中。茉莉酸(jasmonic acid,JA)处理诱导AtAGO2蛋白在细胞质膜及其周围"颗粒化"聚集,但抗病诱导剂苯并噻二唑(benzothiodiazole,BTH)处理不影响AtAGO2蛋白的亚细胞定位。这些结果说明AtAGO2可能通过JA途径参与植物抗病性的调控。     

猪圆环病毒II 型 rep蛋白的亚细胞定位生物信息学析

从GenBank 发表的PCV-2全基因组序列,随机选择其中的32 个全基因序列,做序列比对和同源性比较,绘制系统进化树,在注释中找到ORF1编码的rep蛋白氨基酸序列, 用在线生物信息学工具对其进行亚细胞定位分析.结果基本符合"来自同一地区的基因序列同源性较高"的规律,表明了PCV的高度保守性, 亚细胞定位分析发现其rep蛋白定位于核区的指数为0.76,这与病毒在宿主细胞核内复制分不开.结果同时表明其定位于过氧化物酶体的指数显著不同于其他(过氧化物酶体平均0.36,可变,溶酶体、线粒体均为0.1不变)这可能与pcv的组织嗜性以及复制靶细胞(多为单核/巨噬细胞)的原因相关.     

水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式

为了探明盐敏感相关基因[OsSsr1（Oryza sativa L.salt-sensitive related gene 1,GenBank登录号为NM₀01065574）]的亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式,通过生物信息学手段、洋葱表皮亚细胞定位、RiceXPro数据库和Real-time PCR对其进行研究。序列分析表明OsSsr1的开放阅读框为2 004 bp,编码一个由667个氨基酸组成并含有5个跨膜区的蛋白质,该蛋白质N端含有一个信号肽;其启动子序列包含TGACG-motif、ABRE、TCA-element和W box等多个与逆境相关的顺式作用元件。GFP融合表达显示,OsSSR1蛋白质定位于细胞膜。RiceXPro数据库中数据分析表明,OsSsr1基因在水稻不同发育期的不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,胚中的表达量最低。Real-time PCR结果表明,OsSsr1表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、MeJA和ABA的诱导上调。这些结果显示,OsSsr1基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。     

根瘤农杆菌T-DNA结合蛋白VirD2和VirE2在水稻中的亚细胞定位研究

根瘤农杆菌侵染植物过程中,至少有5种毒性蛋白（Vir）进入宿主细胞发挥作用,而其中VirD2与VirE2的作用最为关键,研究二者在水稻中的亚细胞定位,对农杆菌介导的水稻遗传转化机制的阐明具有重要意义。利用水稻叶鞘原生质体瞬时表达系统,发现3种冠瘿碱型的VirD2均只定位于细胞核中,与在拟南芥中相同;而3种冠瘿碱型的VirE2均主要定位于细胞核中,但在细胞质中仍有较多分布,与在拟南芥中的定位不同。因此,推测不同冠瘿碱型的农杆菌对水稻侵染能力的差异与VirD2和VirE2亚细胞定位的关系不大;同时表明根瘤农杆菌介导的拟南芥及水稻遗传转化机制存在相似性,但也有不同之处。     

马铃薯StRab蛋白序列特征和亚细胞定位分析

为进一步探索StRab蛋白在胁迫反应中的功能及其作用机制,采用生物信息学、洋葱表皮亚细胞定位等方法进行研究。结果表明,StRab核酸序列为889bp,其中,编码区为612bp,编码203个氨基酸;StRab蛋白为稳定、可溶、非分泌的非跨膜蛋白,含有小G蛋白家族的全部序列特征,且C端存在CAAX基序。洋葱表皮细胞瞬时转化试验表明,StRab蛋白定位于细胞膜。说明:StRab蛋白是在细胞膜上发挥功能的膜附着蛋白,可能对马铃薯胁迫反应有重要作用。     

‘南通小方柿’GA2ox基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

【目的】从地方矮化品种‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi)中分离赤霉素合成关键酶基因GA2ox,并进行亚细胞定位及表达分析,为进一步探索其矮生性状形成机理及选育新型矮生品种奠定基础。【方法】以‘南通小方柿’幼嫩叶片为材料,通过改良的CTAB法提取总RNA,利用简并引物克隆GA2ox家族中2个基因的片段,采用3′和5′RACE方法得到基因的全长c DNA序列,分别命名为Dk GA2ox1和Dk GA2ox2。通过生物信息学方法分析结构特征,利用GFP进行亚细胞定位,实时荧光定量RT-PCR技术研究其在发芽期、展叶期、枯顶期、开花期、生理落果期、果实着色期、果实成熟期中的表达特性。【结果】生物信息学分析Dk GA2ox1和Dk GA2ox2全长c DNA序列分别为1 318 bp和1 267 bp,分别含有198 bp和61 bp的5′非翻译区及97 bp和172 bp的3′非翻译区。编码332个和334个氨基酸,与毛白杨(JX102472.1)、夹竹桃(AY594292.1)、烟草(AB125232.1)、矮牵牛(GU059939.1)、苹果(FJ571521.1)、梨(JF441168.1)、葡萄(JQ608472.1)的相似度达73%—77%。含有保守20G-Fe(Ⅱ)-Oxy蛋白结构域,高度保守的2-酮戊二酸结合位点(Dk GA2ox1:Arg-272、Ser-274;Dk GA2ox2:Arg-271、Ser-273)和Fe2+结合位点(Dk GA2ox1:His-205、Asp-207、His-262;Dk GA2ox2:His-204、Asp-206、His-261),有赤霉素2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点。Dk GA2ox1和Dk GA2ox2编码蛋白分子量分别为36 596.1 Da和37 544.2 Da,均为稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,无明显疏水区,属于C19-GAoxs。瞬时表达载体的构建及洋葱表皮细胞转化后,洋葱表皮细胞的瞬时表达结果显示,Dk GA2ox1编码蛋白定位于细胞核和细胞质中。Dk GA2ox1和Dk GA2ox2在开花期表达最丰富,并在7个典型物候期中均高于乔化品种‘大方柿’。【结论】南通小方柿中赤霉素2-氧化酶基因的表达与其矮生性状有关。     

斜带石斑鱼PKR基因的克隆表达及亚细胞定位分析

根据实验室前期获得的斜带石斑鱼PKR基因的全长c DNA,对其原核表达、组织分布及亚细胞定位进行了研究分析。结果表明,斜带石斑鱼PKR基因c DNA全长为2 151 bp,其中ORF区为1 863 bp,编码621个氨基酸,表达蛋白的分子质量大小为70 157.15 Da,PI为5.72。通过NCBI网站上BLAST软件比对发现,斜带石斑鱼PKR与其他物种的PKR高度同源。通过构建原核表达载体PKR-p ET-32a,获得了斜带石斑鱼PKR的融合蛋白,经纯化后制备了斜带石斑鱼PKR鼠抗血清。利用荧光定量PCR对斜带石斑鱼PKR基因组织分布研究表明,该基因在所有检测组织中均有表达,其中肠的表达量最高,头肾次之。以荧光显微镜对其亚细胞定位进行了分析,该基因为全细胞分布,但主要分布于细胞质中。     

菊花翻译起始因子4E基因的克隆、 表达分析及其互作蛋白的筛选

【目的】为了研究翻译起始因子4E在菊花中的表达特性及功能,克隆菊花翻译起始因子4E（CmeIF4E）基因,分析其表达特性并初步筛选得到菊花CmeIF4E的互作蛋白。【方法】根据已报道植物的eIF4E序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术克隆菊花eIF4E基因,荧光定量PCR及亚细胞定位分析菊花CmeIF4E的表达特性,并用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白。【结果】克隆获得菊花eIF4E基因全长914 bp,其开放阅读框（ORF）654 bp,编码1条包含218个氨基酸残基的多肽,将该基因名为CmeIF4E,GenBank登录号为JQ904591。氨基酸序列比对和系统进化分析表明,菊花CmeIF4E与已报道的莴苣的同源基因亲缘关系最近,该结果与植物分类学相符。荧光定量PCR分析结果显示,CmeIF4E基因在切花菊‘神马’各个器官中均有表达,幼嫩的根中表达量最高,其次是叶片,而茎中表达量最低。亚细胞定位分析发现,CmeIF4E在细胞的核、质、膜上都有表达。筛选得到菊花CmeIF4E互作蛋白,其中包括蛋白翻译和翻译后修饰、光合作用、抗逆和防御等相关蛋白。【结论】CmeIF4E在菊花组织中为组成型表达,亚细胞定位显示其在细胞核、细胞质、细胞膜上都有表达。候选蛋白分析验证了CmeIF4E在翻译起始中的作用,还推测其可能与光合系统、植物的抗逆防御相关,结果为进一步研究该蛋白在菊花中的作用提供了重要依据。     

柑橘CitPG34的克隆、定位与表达分析

【目的】 多聚半乳糖醛酸酶是一类参与细胞壁降解的水解酶,在植物生长发育和器官脱落过程中发挥着重要作用。本研究克隆柑橘CitPG34及其启动子（CitPG34-P）并进行表达分析,为深入研究柑橘PG在幼果脱落过程的生物功能奠定基础。【方法】 以‘塔罗科’血橙（Citrus sinensis L. Osbeck）为材料,克隆CitPG34及其启动子,利用ProtParam、Cello、CLUSTALX、MEGA5.2、PlantCARE等软件对其蛋白特性及启动子顺式作用元件进行分析预测;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析CitPG34在不同组织以及柑橘幼果脱落过程中的表达水平。采用同源重组的方法构建pCAMBIA1302-CitPG34-GFP融合蛋白表达载体和CitPG34启动子表达载体（CitPG34-P::gus）,分别用于亚细胞定位和启动子活性分析。【结果】 从‘塔罗科’血橙幼果离层中克隆获得CitPG34,其ORF为1 194 bp,编码397个氨基酸,预测蛋白分子量为41.47 kD,理论等电点为5.19,其不稳定系数为30.23,表明CitPG34属于稳定蛋白;通过在线软件TMHMM分析发现：CitPG34为跨膜蛋白,具有一个跨膜结构,位于第7—29位氨基酸之间。在CitPG34二级结构中,α-螺旋结构约占15.37%,扩展链约占29.72%,无规则卷曲约占54.91%,与其三级结构预测基本一致。NJ树分析显示CitPG34与西洋梨PcPG3（BAF42034）亲缘关系最近,表明CitPG34可能与果实脱落和软化相关。qRT-PCR分析表明,CitPG34在花中表达量最高,在根、叶、离层A、离层C中表达量较低,在幼果中几乎不表达。1-氨基环丙烷羧酸（ACC）处理果梗后能显著提高离层A中CitPG34的表达水平,相反IAA抑制其转录。此外,在柑橘幼果正常脱落过程中,CitPG34表达明显升高。亚细胞定位发现,CitPG34主要位于细胞壁。克隆获取CitPG34起始密码子（ATG）前2 075 bp启动子序列（CitPG34-P）,PlantCare预测发现,在CitPG34-P序列上存在多种顺式调控元件,如核心启动元件TATA-box、增强子元件CAAT-box以及脱落酸响应元件ABRE等。将CitPG34-P::gus转入烟草,通过GUS组织化学染色发现,该启动子受乙烯诱导,主要在叶脉和毛状体中表达。【结论】 CitPG34的ORF长度为1 194 bp,可编码397个氨基酸,其蛋白主要位于细胞壁;该基因具有明显的组织特异性,在花中表达最高;CitPG34表达量与柑橘幼果脱落显著相关。上述结果表明,CitPG34在柑橘幼果脱落和花发育过程中可能发挥着重要的生物功能。     

茄子SmWOX13基因的克隆、亚细胞定位及序列分析

WUSCHEL-related homeobox基因编码保守的转录因子家族在植物发育中起着非常重要的作用。本文从茄子中克隆了SmWOX13基因,该基因cDNA序列全长1 233 bp,包含834 bp编码序列。推导氨基酸序列用于分析该基因的保守性及生成3D结构。扩增获得的基因组序列被用于该基因结构的分析。SmWOX13与GFP融合蛋白的亚细胞定位结果表明该蛋白被定位于细胞核。系统发生树显示茄子SmWOX13基因与番茄WOX8和拟南芥WOX13属于同一个分支。综上结果可表明茄子SmWOX13基因可能与之前报道的番茄和拟南芥WOX基因类似,参与了果实形状的控制。     

枳SPL9和SPL13全长cDNA克隆、亚细胞定位和表达分析

【目的】从枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]中克隆SBP类[SQUAMOSA(SQUA)promoter-binding-like]转录因子基因SPL9和SPL13全长,构建SPL9和SPL13亚细胞定位表达载体验证其是否具有核定位功能,利用荧光定量PCR研究其在枳不同组织的表达特性,初步确定SPL9和SPL13在枳生长发育过程中的作用。【方法】利用生物信息学结合RACE技术以枳花器官的cDNA为模板,克隆出SPL9和SPL13基因全长,分别命名Pt-SPL9和Pt-SPL13,大小分别是1519bp和1824bp,在GenBank的登录号分别是FJ502237和FJ502238;构建Pt-SPL9和Pt-SPL13亚细胞定位载体35S-GW-FJ502237/FJ502238-GFP,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24h后激光共聚焦显微镜下观察;利用SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测Pt-SPL9和Pt-SPL13在根、茎、叶、花序、花和果等不同组织中的表达。【结果】生物信息学分析表明,Pt-SPL9和Pt-SPL13的cDNA序列中都有microRNA156的识别位点,Pt-SPL9与金鱼草、拟南芥和玉米SPL9的同源性分别为48.9%、42.5%和41.7%;Pt-SPL13与拟南芥SPL13、水稻的SPL16和玉米的TGA1同源性分别为40.8%、38.1%和35.8%。Pt-SPL9和Pt-SPL13与其它植物的SBP一样有着高度保守的序列,即SBP结构域和一个双向核定位信号KRXXXRRRK。亚细胞定位结果表明,Pt-SPL9和Pt-SPL13均定位于细胞核中。SYBR Green I实时定量RT-PCR结果表明,Pt-SPL9和Pt-SPL13在各个器官均有表达,但表达量不同,Pt-SPL9在茎中的表达量最高,在花和叶中的表达量次之,在根、花芽和幼果中的表达量最低;Pt-SPL13在幼果中的表达量最高,在茎和花芽中的表达量相当,其次为叶,在花和根中的表达量很低。【结论】转录因子Pt-SPL9和Pt-SPL13均具有核定位功能,Pt-SPL9和Pt-SPL13对枳的茎和果实的发育可能有着重要作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白的亚细胞定位与功能预测

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位,并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化,首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能,之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞,并接种PRRSV,通过间接免疫荧光方法检测NSP9蛋白的表达与定位情况。功能预测结果表明,NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。间接免疫荧光检测结果显示,PRRSV感染之初,NSP9蛋白定位在Marc-145细胞质中,围绕在细胞核附近,随PRRSV感染时间延长,其逐步往细胞核内转移,转移的面积也逐步增多。可见,PRRSV感染会引起NSP9蛋白向核内转移。     

小麦ERF类转录因子W17的结合特异性及亚细胞定位分析

 【目的】构建ERF（ethylene-responsive element binding factor）转录因子基因W17的亚细胞定位载体和原核表达载体,验证W17是否具有核定位功能,阐明W17与GCC、DRE探针的体外结合特性,利用GUS瞬时表达系统分析W17蛋白的体内结合特性和转录激活功能,初步预测W17在植物胁迫信号传导途径中的作用。【方法】构建W17/163hGFP亚细胞定位载体,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24 h后共聚焦显微镜下观察。构建W17/pGEX-4T-1原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG（0.5 mmol•L-1,3 h）诱导,GST纯化柱纯化,纯化的融合蛋白与[γ-32P]ATP标记的GCC、DRE探针混合进行凝胶阻滞试验。构建GUS瞬时表达系统,通过农杆菌介导转化烟草,X-Gluc染色、酒精脱色后体视显微镜下观察。【结果】W17基因具有核定位功能,纯化的融合蛋白GST/W17能与正常GCC、DRE探针体外特异结合,与突变GCC、DRE探针不结合,在植物体内与GCC特异结合并能激活下游GUS基因表达。【结论】W17通过自身的NLS进入核内行使功能,参与了GCC-box调控的生物胁迫信号传导途径,还可能参与了非生物胁迫（盐胁迫）传导途径。