拟南芥高迁移率族蛋白B(HMGB)族基因的克隆及表达分析

[目的]为研究高等植物高迁移率族蛋白B家族的功能及作用模式。[方法]运用RT-PCR方法克隆出拟南芥HMGB蛋白家族中的3个基因：At2G34450、At5G23405、At5G23420,并运用SDS-PAGE、Northern检测及亚细胞定位等手段检测这3种蛋白在大肠杆菌及拟南芥中的表达。[结果]经鉴定,以上3种蛋白的分子量分别为17.5、17.0和27.5 kD,在拟南芥中表达量At5G23420〉At5G23405〉At2G34450,且这3种蛋白均定位于细胞核内。[结论]该研究结果为深入研究高等植物中HMGB家族蛋白的生物学功能奠定了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化(英文)

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母中的表达及纯化

[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450的表达及功能鉴定(摘要)(英文)

[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B(HMGB)在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其分别转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450的表达及功能鉴定

[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B（HMGB）在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5＇非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1 b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPaseRABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明,T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5′非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPase RABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

拟南芥细胞周期基因AtCDC5的功能研究及抗体制备

MYB相关CDC5 (Cell division cycle 5)蛋白对于细胞周期G2期的正常进行是必须的,但是在植物中对这种蛋白质的研究还较少涉及。本试验测量比较野生型拟南芥(Col-0生态型)和At CDC5 T-DNA插入缺失突变体(GK_278B09)的主根生长速度和长度,利用瞬时表达At CDC5-GFP研究At CDC5在拟南芥叶片叶肉细胞中的定位,同时利用At CDC5 N端144个氨基酸在大肠杆菌中进行原核表达和纯化,免疫家兔获得针对At CDC5的多克隆特异性抗体,从表型、细胞和蛋白质水平研究At CDC5基因的功能。结果表明,GK_278B09的主根因发育受到抑制而生长速度缓慢; At CDC5-GFP融合蛋白主要定位于细胞核中;经过分离得到的At CDC5蛋白抗血清能够有效地检测出10 ng原核表达的At CDC51-144抗原,并在原生质体At CDC5过表达体系中检测出1条分子量约为120 000的条带,此条带与At CDC5-GFP大小相近。本研究成功制备出At CDC5蛋白的多克隆抗体,为进一步研究At CDC5蛋白影响细胞周期从而影响植物生长发育提供了研究基础。     

含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780的构建

[目的]构建含绿色荧光蛋白(gfp)基因的植物重组表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。[方法]用PCR方法扩增psmGFP的GFP片段,BamHI和SacI双酶切PCR产物,同时用BamHI和SacI双酶切pBI121。从琼脂糖凝胶中回收纯化pBI121的大片段,经连接、转化、鉴定出改造后的质粒。[结果]用PCR方法扩增得到长度为740 bp的增强型的绿色荧光蛋白基因片段,克隆入pBI121表达载体后,获得了新的重组质粒pBI121-GFP。分别将编码拟南芥BAG7、BAG4蛋白的基因At5g62390和At3g51780通过PCR方法扩增后,克隆入pBI121-GFP,构建了用于超量表达BAG蛋白基因的GFP融合蛋白双元表达载体pBI121-GFP-62390和pBI121-GFP-51780。利用细胞感受态法将该植物表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101中。[结论]为进一步研究BAG蛋白在拟南芥抗性胁迫中的功能及其在细胞内的动态分布奠定了基础。     

荷花R2R3-MYB转录因子NnMYB4对拟南芥木质素合成的影响

[目的]本文旨在研究荷花R2R3-MYB转录因子NnMYB4的功能,探讨其在木质素合成过程中的作用。[方法]利用RT-PCR技术从荷花品种‘黑龙江红莲’中克隆得到1个MYB转录因子基因c DNA全长开放阅读框(ORF),命名为NnMYB4。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法分析NnMYB4在荷花不同组织中的表达情况。构建p MDC43-NnMYB4过表达载体转化拟南芥,采用乙酰溴法测定转基因植株的木质素含量,通过qRT-PCR技术对木质素合成关键酶基因的表达进行分析。[结果]NnMYB4基因ORF全长726 bp,编码241个氨基酸,属于R2R3-MYB转录因子G4亚组,与拟南芥At MYB4亲缘关系较近。组织定量结果表明,NnMYB4基因在荷花根、茎、叶柄、叶中均有表达,且在幼叶中表达量相对最高,在剑叶中最低。与野生型拟南芥相比,转NnMYB4拟南芥植株花序茎变矮,花期延迟,茎木质部染色面积较小、染色程度变浅,木质素含量显著降低。过表达NnMYB4分析结果显示,转基因拟南芥At C3H、At4CL1、At F5H、At COMT1等木质素合成关键酶基因的表达量显著下调。[结论]荷花NnMYB4可能是木质素合成途径中的一个负调控因子,对植物木质素合成具有负调控作用。     

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。     

拟南芥P5CS1基因转化羽衣甘蓝增强耐盐性分析

【目的】分析转拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因羽衣甘蓝的耐盐性,为获得较强的耐盐性羽衣甘蓝品种及其抗逆育种提供理论依据。【方法】将拟南芥P5CS1基因(AtP5CS1)经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植物中,在盐胁迫下,分别检测转基因植株与野生型植株的AtP5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、株系根系性状、整株干质量和鲜质量、叶片相对水含量、叶片电导率和整株存活率。【结果】在150 mmol/L NaCl胁迫下,转基因植株的P5CS1基因mRNA可正常表达,与对照相比,转基因株系Y1、Y2的主根和最长侧根长度较长,侧根数目较多,整株干质量和鲜质量较重;而且相对水含量显著高于对照植株(P0.05,下同),脯氨酸含量及存活率均极显著高于对照植株(P0.01),叶片相对电导率显著低于对照植株。【结论】转AtP5CS1基因植株的耐盐表型优于对照,即AtP5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的耐盐性。     

拟南芥中 Fibrillarin 基因的克隆.表达.纯化及与 ak6 蛋白相互作用研究

[目的]研究拟南芥中Fibdllarin基因的克隆、表达及纯化，并探索其与ak6蛋白的相互作用。[方法]利用pGEX-6P-1与Fibrilla—r流基因构建重组表达质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，运用同样方法构建PET-28a—ak6原核表达质粒，获得His—ak6融合蛋白，并运用体外pulldown技术验证二者的相互作用。f结果l在温度为37℃、诱导时间为16～20h、IPTG浓度为0．5mmol／L时，fibrillarin蛋白的纯化浓度最高。试验成功获得了符合标准的RNA，并获得了与预期片段大小相符的清晰的目的条带；pull—down试验结果表明，拟南芥中fibrillarin蛋白与ak6蛋白具有相互作用。[结论]拟南芥ak6突变体植株可能由于ak6的缺失影响了rRNA前体的加工，从而抑制核糖体的合成，进而阻碍拟南芥茎的生长，使植株表现明显的矮小症状。     

毛竹早期光诱导蛋白基因克隆及功能分析

  目的  探究早期光诱导蛋白(ELIP)基因在竹子光保护中的作用,为进一步阐述竹子光保护机制提供参考依据。  方法  以毛竹Phyllostachys edulis实生苗为材料,在前期研究的基础上克隆毛竹ELIP基因,利用qRT-PCR技术研究其在不同光照诱导下的表达谱,同时通过在拟南芥Arabidopsis thaliana中异位表达对1个基因的功能进行初步鉴定。  结果  克隆获得了3个毛竹ELIP基因(PeELIP1、PeELIP2和PeELIP3),分别编码165、179和182个氨基酸。蛋白结构分析表明:3个PeELIPs蛋白均具有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,含3个α-螺旋跨膜结构,属于叶绿素a/b结合蛋白超家族。序列比对及进化分析表明:PeELIPs与水稻Oryza sativa、玉米Zea mays等单子叶植物的ELIPs相似性较高,同源性达72%以上,聚类在同一分支。qRT-PCR分析表明:3个PeELIPs基因在毛竹黄化苗中仅检测到微弱表达,光照处理使3个基因的表达量均显著上调;同时在正常毛竹实生苗叶片中,随着光照强度的增强和强光胁迫处理时间的延长,3个PeELIPs基因的表达量都显著上调。过表达PeELIP3可减缓转基因拟南芥在强光下F_v/F_m的下降幅度,但未影响转基因植株的非光化学猝灭系数。  结论  毛竹中至少存在3个PeELIPs,且其表达均受光照的诱导。过量表达PeELIP3能够减缓转基因拟南芥受光抑制的程度,具有一定的光保护作用。图8表1参40     

4种醇类化合物在根部的施用对拟南芥生理特性和光合作用相关基因表达的影响

[目的]研究4种醇类化合物在根部的施用对拟南芥生理特性和光合作用相关基因表达的影响。[方法]分别用含3个不同浓度(2、4、6 mmol/L)甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇的MS培养基培养拟南芥幼苗,研究其对拟南芥生长的影响。[结果]2～4 mmol/L的醇类化合物对拟南芥幼苗的生长都有促进作用,其中促进作用最强的为2 mmol/L正丁醇,处理3周后植株鲜重与对照组相比增加了2.7倍以上,总蛋白和可溶性多糖含量也明显高于未经醇类化合物处理的植株,相较于对照组最多增加了78.5%和58.6%。光合色素含量也明显升高,且光合作用相关的一些基因的表达也在醇类化合物作用下明显上调。[结论]该研究为醇类化合物可促进拟南芥的生长这一理论提供了分子生物学方面的证据。