猪JHDM2A基因的克隆及表达分析

试验旨在克隆猪JHDM2A基因,并研究其在猪卵巢组织中的表达情况。首先克隆猪JHDM2A基因,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体,同时对JHDM2A基因在猪卵泡发育过程中的表达情况进行分析。结果显示,克隆得到的猪JHDM2A基因编码区长度为3 945 bp,编码1 315个氨基酸。通过多重氨基酸序列比对发现,猪JHDM2A基因与黄牛、水牛、绵羊和人相应氨基酸序列的同源性分别为93.5%、94.7%、94.7%和93.8%。蛋白质分子系统进化树分析结果表明,JHDM2A基因在物种进化过程中高度保守。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A真核表达载体导入HEK293T细胞,可观察到清晰的绿色荧光蛋白表达。免疫组化结果显示,JHDM2A蛋白在不同发育阶段猪卵泡中均有表达。本试验通过克隆获得猪JHDM2A基因序列,JHDM2A蛋白在猪卵巢中高度表达,表明其功能可能与猪卵泡发育密切相关。     

过表达MAT2A基因促进猪肌内脂肪细胞分化的研究

本研究通过构建腺病毒介导的体外超表达载体,探究腺苷甲硫氨酸转移酶2A（methionine adenosyltransferase 2A,MAT2A）基因在猪肌内脂肪细胞分化中的作用。根据GenBank中猪MAT2A基因mRNA序列（登录号：NM_001167650.1）设计引物,提取猪脂肪组织细胞总RNA并反转录获得cDNA,以此为模板进行PCR扩增并连接到pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中,对重组质粒pAd-MAT2A进行测序鉴定;pAd-MAT2A载体经PacⅠ限制酶酶切线性化,经质粒大片段回收纯化后转染293A细胞进行病毒包装;采用实时荧光定量PCR检测MAT2A基因表达情况,并提取蛋白进行Western blotting分析,取分化第8天的细胞进行油红O染色。结果表明,穿梭载体pAdTrack-CMV-MAT2A构建成功,并能与骨架载体pAdEasy-1实现同源重组;腺病毒载体pAd-MAT2A转染293A细胞后,病毒滴度达到1E+6 PFU/mL,可满足侵染猪肌内脂肪细胞的需要。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,MAT2A基因mRNA和蛋白水平均显著上调。油红O染色结果显示,过表达MAT2A基因可促进猪肌内脂肪细胞内脂滴聚积。结果表明,腺病毒介导的MAT2A基因过表达在猪肌内脂肪细胞中呈上调趋势,MAT2A基因可促进脂质积累。     

猪圆环病毒2型多表位串联体诱导表达及其免疫活性

为了获得体外诱导表达的具有良好免疫原性的PCV2多表位串联体。本试验筛选PCV2主要抗原表位,顺序组成多表位串联体,人工合成其cDNA序列,通过BamHⅠ和SalⅠ定向克隆至原核表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,转化BL21感受态细胞,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达。使用SDS-PAGE对目的基因表达情况进行分析,提取与纯化融合蛋白多肽,Western blot鉴定表达多表位串联蛋白免疫活性。融合蛋白多肽免疫BALB/c小鼠,ELISA测定其抗体,评价其免疫原性。结果显示,成功构建了含7个PCV2抗原表位串联体的表达重组质粒pEGX-4T-1-ep,SDS-PAGE分析显示,融合蛋白多肽在大肠杆菌中获得了有效表达,其分子量约35ku,主要以可溶性形式存在。Western blot结果显示,提取与纯化融合蛋白多肽与PCV2阳性血清具有良好的反应原性。ELISA检测结果显示,纯化的融合蛋白多肽可有效刺激机体产生PCV2特异性抗体,具有良好的免疫原性。结果表明,构建的PCV2多表位串联体表达重组体具有良好的体外表达特性,表达蛋白具有良好的免疫原性。该研究为PCV2表位筛选,功能鉴定及多表位疫苗研究奠定了一定基础。     

高脂诱导非酒精性脂肪肝对CYP2A5表达的影响

为了研究高脂诱导脂肪肝对CYP2A5表达的影响,选取雄性C57BL/6J小鼠18只,随机分成对照组(control)、高脂组(NAFLD)和阳性对照组(PYR),每组6只,分别饲喂基础饲料和高脂饲料,阳性对照组饲喂基础饲料在处死前一天给予吡唑诱导,连续8周后小鼠断颈处死,取肝脏测定mRNA,CYP2A5的蛋白表达和酶活性。其结果阳性对照组CYP2A5的mRNA、蛋白表达和酶活性与对照组相比分别增加229%、80%、151%差异极显著(P0.01)。高脂诱导组与对照组相比CYP2A5的mRNA、蛋白表达和酶活性分别增加69%、34%、43%(P0.01)。表明高脂诱导非酒精性脂肪肝可增加CYP2A5的mRNA、蛋白表达水平和酶活力。     

猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2/猪白介素-2(PoIL-2)嵌合重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性ELISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3.1/ORF2质粒;在rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒或rpcDNA3.1/ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒为下一步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2／猪白介素-2（PoIL-2）嵌合重组表达质粒（rpcDNA3．1／PCV2-linke PoIL-2）在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3．1／PCV2-linker-PolL2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc）亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性EI。ISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3．1／PCV2qinker-PolL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3．1／oRF2质粒;在rpcD—NA3．1／PCV2-linkePolL-2质粒或rpcDNA3．I／ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3．1／PCV2-linkerPoIL-2质粒为下-步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

影响猪体细胞核移植效率的因素

卵母细胞对猪核移植效率的影响,包括卵泡直径、成熟培养前卵母细胞正确的分级、体外成熟培养液、激素等;供体细胞对猪核移植效率的影响,包括细胞类型的选择、供体细胞所处的细胞周期;不同核移植方法的影响,包括去核方法、融合方法、激活。     

疫苗诱导对猪肺炎支原体的免疫防卫

疾病防制策略包括调整宿主 (猪 )和入侵者 (猪肺炎支原体 )之间的关系。本文介绍的一种策略是利用免疫接种激活猪的免疫系统。对于猪肺炎支原体的免疫应答 (包括体液、粘膜和细胞介导的各个系统 )非常复杂 ,是当前的热门研究课题。不断进行的研究增加了我们对这一破坏性微生物致病机理的了解     

猪膜联蛋白A2多克隆抗体的制备、亲和纯化与鉴定

本研究旨在制备并亲和纯化兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。通过PCR从质粒pA2-EGFP中将编码猪膜联蛋白A2与增强型绿色荧光蛋白融合基因(Annex A2-EGFP)亚克隆到pET-30a(+),构建了原核表达质粒p30a/AE,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导以包涵体形式表达了猪ANNXA2-EGFP融合蛋白,用Ni-Resin HP树脂对表达的目的蛋白进行亲和纯化。用纯化的ANNXA2-EGFP融合蛋白免疫兔,制备兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。将以前纯化的猪可溶性GST-ANNXA2融合蛋白偶联NHS活化琼脂糖凝胶FF,亲和纯化多克隆抗体。用GST-ANNXA2亲和纯化的多抗效价达到1∶12800,Western blot和免疫组化结果证实具有高特异性。制备的高效价和高特异性兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体,为进一步研究膜联蛋白A2在病毒感染中的作用奠定了基础。     

Cloning and Expression Analysis of Porcine JHDM2A Gene

The aim of this study was to clone the JHDM2A gene of porcine and study the expression of JHDM2A gene in porcine ovary. In this study, we cloned the porcine JHDM2A gene and constructed its eukaryotic expression vector, the expression of JHDM2A gene in porcine ovarian tissue was also analyzed. The results showed that the cloned CDS length of porcine JHDM2A gene was 3 945 bp, which encoded 1 315 amino acids. The results of multiple amino acid sequence comparison showed that the porcine JHDM2A shared 93.5%, 94.7%, 94.7% and 93.8% homologous compared with those of Bubalus bubalis, Bos taurus, Ovis aries and Homo sapiens, respectively. Phylogenetic tree analysis indicated that the JHDM2A gene was highly conservative in the evolutionary process. The pLVX-IRES-ZsGreen1-JHDM2A eukaryotic expression vector was constructed, and clear green fluorescent signal was observed when the plasmid was transfected into HEK293T cells by liposome method. The immunohistochemical results showed that the JHDM2A protein was expressed in porcine follicle of different development stages.The results showed that the porcine JHDM2A gene sequences was cloned, and the JHDM2A protein was highly expressed in porcine ovary, indicating that its function might be closely related to the development of porcine follicular.     

猪胎盘效率与繁殖性能的关系

本文综述了猪高繁殖力的生理机制研究进展 ,对近年来关于猪胎盘效率与产仔数关系以及胎盘效率与生产性状间的关系研究进行了详细描述 ,从胎盘效率这一综合指标探讨猪高繁殖力的生理基础 ,目前的研究结果表明 ,基于胎盘效率的选择是提高猪的窝产仔数行之有效的方法     

杜洛克猪饲料利用效率测定阶段及RFI校正公式研究

为了解决中国猪育种过程中饲料利用效率测定期长、无校正公式等问题,本研究对应用4种不同方法计算的杜洛克猪全期和不同生长阶段的剩余采食量（RFI）进行了Pearson相关性分析,以得到可代表全期RFI的测定阶段,进而缩短测定时间。应用不同体重RFI线性插值与达100 kg真实体重RFI对杜洛克猪达100 kg体重RFI校正公式参数进行拟合求解,以得到杜洛克猪达100 kg体重RFI校正系数。结果显示,4种方法计算的RFI均为105~180 d生长阶段和全期相关性最高,相关系数均在0.92以上,适配回归方程为：全期RFI=0.9786×（105~108 d测定阶段RFI）+0.0002,最高拟合度为0.9734。杜洛克公猪及母猪达100 kg体重RFI校正系数分别为0.0519和0.0179。在此系数下,公猪70~100 kg范围内校正准确性较高,母猪40~100 kg范围内校正均比较准确。本试验结果可直接用于制定育种方案,既可缩短RFI测定的时间,又可为更准确地计算RFI提供参考,为制定优良的育种方案提供有效数据。     

松辽黑猪NR5A2基因多态性及其与繁殖性状的关联分析

试验旨在探究松辽黑猪NR5A2基因多态性及其与繁殖性状的关联性。选取130头松辽黑猪作为研究对象,利用PCR直接测序法查找NR5A2基因6个外显子的SNP位点,通过HRM分型技术分析SNP位点的多态性,使用SPSS 19.0软件分析NR5A2基因SNP位点多态性与母猪总产仔数、产活仔数、仔猪初生重、3周龄重、断奶重及断奶仔猪数、乳头数的关联性。结果显示,松辽黑猪NR5A2基因第6外显子上存在1个SNP位点（C99T）,检测到3种基因型：CC、CT和TT。群体遗传参数分析及卡方适合性检验结果显示,该SNP位点在松辽黑猪群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）,但C/T突变位点杂合度相对较低,在松辽黑猪群体中的变异较小,属于中度多态（0.25<PIC<0.5）。关联性分析结果表明,在NR5A2基因C99T位点上,CC基因型个体的总产仔数、产活仔数及断奶仔猪数均最高,且显著高于TT基因型（P<0.05）,产活仔数及断奶仔猪数均显著高于CT基因型（P<0.05）;各基因型仔猪初生重、3周龄重、断奶重及乳头数均无显著差异（P>0.05）。综上所述,NR5A2基因第6外显子存在突变位点C99T,与松辽黑猪产仔数存在显著关联性,但该突变位点能否作为松辽黑猪产仔数的遗传标记,需要对更大的群体进行进一步研究。     

Polymorphism and Tissue Expression Patterns of CKMT2 Gene in Tibetan and Yorkshire Pigs

In order to explore the polymorphism site and difference of expression level of creatine kinase,mitochondrial 2 (CKMT2) gene in muscle segments of Tibetan and Yorkshire pigs,in this experiment,Sanger sequencing method was used to screen and genotype the single nucleotide polymorphism (SNPs) in the 1 000 bp region upstream of the initiation codon of CKMT2 gene in 50 Tibetan and 60 Yorkshire pigs.The expression of CKMT2 gene was detected by Real-time quantitative PCR in heart,back fat and longissimus dorsi muscle of 180-day-old of 10 Tibetan and 10 Yorkshire pigs.The results showed that 5 SNPs (G-357A,T-469C,G-649T,A-784G and A-953G) were found in the upstream 1 000 bp region of the initiation codon of CKMT2 gene,the allele frequency of Tibetan pigs at all sites were significantly different from those of Yorkshire pigs.These SNPs were related to skeletal muscle growth and development,muscle energy metabolism and anti-hypoxia.The mRNA expression of CKMT2 gene in longissimus dorsi muscle and heart of Tibetan pigs were extremely significantly higher than Yorkshire pigs (P<0.01),and the mRNA expression in back fat of Tibetan pigs was extremely significantly lower than Yorkshire pig (P<0.01),which indicated that CKMT2 gene could positively regulate anti-hypoxia and muscle tissue production,and negatively regulate fat production,the analysis results were consistent with the breed characteristics of Tibetan and Yorkshire pigs.This experiment results provided some new ideas for further exploration of pig growth and development,fat deposition and hypoxia adaptability.     

藏猪和大约克猪CKMT2基因多态性分析及其组织表达模式

为探究藏猪和大约克猪肌节线粒体肌酸激酶2（creatine kinase,mitochondrial 2,CKMT2）基因多态性位点及其在各组织中的表达差异,试验采用Sanger测序法对藏猪（50头）和大约克猪（60头）CKMT2基因起始密码子上游1 000 bp区域进行单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）筛选与基因分型;180日龄藏猪和大约克猪（各10头）屠宰后分别采集心脏、背脂和背最长肌组织,采用实时荧光定量PCR技术检测CKMT2基因在各组织中的表达水平。结果显示,在CKMT2基因起始密码子上游1 000 bp区域,筛选到5个SNPs位点：G-357A、T-469C、G-649T、A-784G和A-953G,且藏猪与大约克猪等位基因频率差异明显。转录因子预测发现,这些SNPs位点与骨骼肌生长发育、肌肉能量代谢、抗缺氧有关。藏猪CKMT2基因在背最长肌和心脏组织中的mRNA表达量极显著高于大约克猪（P<0.01）,在背脂中的mRNA表达量极显著低于大约克猪（P<0.01）,推测CKMT2基因具有正向调控抗低氧和肌肉组织生成、负向调控脂肪生成的作用,该分析结果与藏猪和大约克猪的品种特性相吻合。本试验结果为进一步探索猪生长发育、脂肪沉积和低氧适应性提供了一定的新思路。     

LRH-A_3对全奶母牦牛的诱导发情效果和作用机理初探

本研究初步探讨了促性腺素释放激素类似物 (LRH A3 )对全奶母牦牛 (在当年 4～ 6月份产犊的泌乳母牦牛 )的诱导发情排卵效果及机理。 1998年 7月对试验组 (n =2 0 )母牦牛注射LRH A3 (30 0 μg/头 ) ,对照组 (n =42 )未作任何处理。9月 15日前用普通牛公牛配种 ,9月 15日后用公牦牛补配。 1999年产犊率为试验组 5 0 .0 % (10 / 2 0 ) ,对照组 2 8.6 %(2 0 / 42 ) ,试验组和对照组差异极显著 (P <0 .0 1)。对 5头母牦牛在注射LRH A3 前 30min及注射后 30 ,45和 6 0min血清中促黄体素 (LH)浓度测定以进一步探明全奶母牦牛诱导发情第一情期受胎率低的原因。结果发现 ,虽然注射LRH A3后 6 0min全奶母牦牛血清中LH浓度显著升高 (P <0 .0 5 ) ,但该峰值 (3.34± 0 .6 7ng/ml,n =5 )未达到自然发情排卵的LH峰值 (17.182 9± 2 .1174ng/ml)。     

复合酶制剂对生长肥育猪的饲喂效果

选用体重27kg的杜长大三元杂交生长肥育猪42头,随机分成对照组和试验组,每组3个重复组,对照组饲喂基础日粮,试验组饲喂基础日粮+0.01%复合酶制剂,试验期32d。试验结果表明:复合酶制剂可将猪平均日增重提高0.057kg(P<0.05);平均日采食量降低0.072kg,饲料增重比降低13.31%;每千克增重饲料成本降低0.605元,经济效益提高了12.62%。     

不同体重阶段川藏黑猪和杜长大猪肌肉中氨基酸含量研究

为了研究不同猪种背最长肌中氨基酸沉积规律,试验采用高效液相色谱检测了不同体重梯度（90、110和130 kg）的川藏黑猪和杜长大（DLY）猪背最长肌中氨基酸含量。结果表明,谷氨酸在两猪种肌肉中含量最高,含硫氨基酸总量在90和130 kg体重梯度时表现为川藏黑猪显著高于DLY猪（P〈0.05）,110 kg体重梯度时极显著高于DLY猪（P〈0.01）,而同一猪种不同体重梯度间各种氨基酸组成差异均不显著（P〉0.05）,鲜味氨基酸占总氨基酸比例（FAA/TAA）在90 kg体重梯度表现为川藏黑猪极显著高于DLY猪（P〈0.01）,130 kg体重梯度时显著高于DLY猪（P〈0.05）。本研究说明川藏黑猪肌肉中与风味相关的氨基酸含量高于DLY猪,我们认为这也是川藏黑猪的肌肉风味比DLY猪更浓郁的重要原因之一。我们的研究初步揭示了不同猪种背最长肌中氨基酸的沉积规律及构成差异,为进一步研究猪肉风味形成机理提供数据。