鹅星状病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2017年10月—2019年5月,本实验室从广东、四川、河北、山东、安徽、辽宁等广大养鹅地区采集了67份典型雏鹅痛风样品进行了实验室检测以及病原的分离鉴定,检测结果表明：所有样品中均检测到了鹅星状病毒,并且约有94.03%的样品为两个不同种的鹅星状病毒混合感染。病原分离结果表明：鹅星状病毒FLX株的变异株病毒（命名为SCCD）可以在鹅胚上稳定增殖,并且能稳定致死10日龄鹅胚,致病力较鹅星状病毒FLX增强;新型鹅星状病毒株（命名为SDPD）不能在鹅胚和SPF鸡胚上稳定增殖。病毒的基因组测序结果表明：鹅星状病毒FLX株与鹅星状病毒FLX的变异株病毒SCCD株、新型鹅星状病毒SDPD株全基因组核苷酸相似性分别为89.7%、58.1%,ORF1b基因氨基酸相似性分别为98.4%、61.0%,ORF2基因氨基酸相似性分别为81.0%、42.5%。将新分离的鹅星状病毒株接种1日龄健康雏鹅,结果表明,鹅星状病毒SCCD株和鹅星状病毒SDPD株虽然能使雏鹅发生死亡,引起肝炎、肾肿胀和增重减少等变化,但雏鹅均无典型痛风（脏器尿酸盐沉积）表现,而两种鹅星状病毒株混合攻毒能使44%的雏鹅发生典型痛风,并与临床发病症状一致。因此,临床上引起雏鹅痛风的病原可能是两种鹅星状病毒,即新型鹅星状病毒和鹅星状病毒FLX的变异株病毒。     

新型鹅星状病毒的分离鉴定与全基因序列分析

为了解近年鹅星状病毒的流行情况,通过鹅胚接种、鹅胚半数致死量测定(ELD_(50))、RT-PCR检测和基因组序列测定等方法,从2019年山东某养鹅场雏鹅疑似星状病毒引起鹅内脏痛风病的病料中分离出1株新型鹅星状病毒,命名为AstV/Goose/SD776/2019。该分离株能引起鹅胚典型的临床症状,病毒无血凝活性,ELD_(50)为10~(-4.0)/0.2 mL,动物回归试验中死亡的雏鹅可以复制出与临床自然感染相似的病变。用RT-PCR对分离株全基因组序列分析结果显示,分离株的3个ORF和与新型鹅星状病毒毒株(JSHA、SD01、SDPY、GD)的核苷酸和氨基酸同源性较高(99.2%以上);与能导致雏鹅肠炎的鹅星状病毒(FLX)及其他种属禽源星状病毒同源性相对较低,遗传进化分析结果显示,分离株在进化树上与4株新型鹅星状病毒的亲缘关系接近,表明分离毒株为新型鹅星状病毒。     

一株鹅星状病毒的分离鉴定

为了研制预防鹅痛风病的鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)疫苗及卵黄抗体,试验对黑龙江省某养鹅场疑似痛风死亡鹅的肝脏及肾脏组织进行了病原分离,并对分离病毒进行了鹅胚传代、RT-PCR检测、核苷酸序列测定与比对、病毒含量测定及动物回归试验。结果表明:试验分离得到一株鹅星状病毒;分离毒株可致传代鹅胚100%死亡;鹅胚传代尿囊液的RT-PCR检测为阳性;阳性产物核苷酸序列与鹅星状病毒AHDY株基因(登录号为MH410610.1)和FLX株基因(登录号为KY271027.1)核苷酸序列的同源性分别为98%和93%;分离株病毒含量为1×10~(4.83)ELD_(50)/0.2 mL;2日龄健康易感雏鹅接种分离毒株48 h后陆续死亡,剖检表现为心脏、肝脏与输尿管尿酸盐沉积及肾脏出血肿胀,与自然发病雏鹅症状一致。说明该分离毒株为导致雏鹅痛风病的病原,可作为研制鹅星状病毒疫苗及卵黄抗体的候选毒株。     

一株鹅星状病毒变异毒株的基因组特征与致病性分析

旨在研究引起雏鹅痛风的新型鹅星状病毒流行株特征。本试验从安徽省鹅星状病毒阳性雏鹅组织中进行病毒分离,并对分离的毒株进行全基因组测序,随后进行遗传进化分析。结果表明,病毒液接种9~11日龄鹅胚可成功分离到病毒,将其命名为GASTV-ZM株。IFA （indirect immunofluorescence assay）鉴定为阳性。基因组序列分析表明,ZM株鹅星状病毒基因组全长7 175 nt,ORF2基因核苷酸和氨基酸与2014—2020年间分离毒株的同源性分别为96.7%~98.9%和96.9%~99.0%,ORF2基因编码的氨基酸序列结果显示,3个氨基酸突变位点与以往存在显著差异,ZM株与2016年以来在我国流行的新型鹅星状病毒处于同一进化分支,与2020分离株HNSQ-6株和XT1株同源性较高。本研究为进一步研究该病毒的致病性和致病机理奠定基础。     

致雏鹅痛风新型鹅星状病毒的分离鉴定和致病性试验

为了解黑龙江省齐齐哈尔市某鹅场雏鹅发病原因,本试验对鹅场疑似感染鹅星状病毒(GoAstV)的雏鹅进行剖检,采集具有典型痛风症状病死鹅的肝脏、脾脏和肾脏,进行病原分离、PCR扩增、基因序列分析和动物回归试验。结果显示,将分离得到的病原接种鹅胚后,72～168 h死亡率约为90%;剖检死亡鹅胚可见尿囊膜水肿并有尿酸盐沉积、胚体严重充血水肿呈潮红色。基因序列比对结果显示,分离毒株与近年来报道的引起禽类痛风的新型GoAstV毒株HNSQ-6、HNKF-1、HNNY0620和XT1的核苷酸同源性较高,达99.58%～99.72%。动物回归试验结果显示,攻毒后雏鹅的临床症状与自然感染雏鹅的发病症状一致;攻毒后雏鹅死亡率约70%,未死亡鹅的生长受到严重抑制;剖检死亡雏鹅可见心脏、肝脏和肾脏表面出现明显的尿酸盐沉着,部分死亡雏鹅关节腔内有尿酸盐沉积。结果表明,从黑龙江省齐齐哈尔市某鹅场病死雏鹅中分离的致病原为GoAstV。     

广东地区致雏鹅痛风鹅星状病毒的鉴定及遗传演化分析

为了解广东地区鹅星状病毒(GoAstV)的流行和变异情况，本研究于2019年～2021年从广东清远、广州、江门和汕尾4个地区采集83份疑似患痛风雏鹅的肝脏和肾脏病料样品。制备的组织病理切片结果显示，痛风雏鹅肝脏和肾脏组织出现大量的炎性细胞浸润和细胞坏死，经RT-PCR检测鉴定到其中72份样品为Go AstV阳性。从4个地区各选1份阳性样品对鉴定到的Go Ast V进行全基因组的PCR扩增，结果显示获得4株长度均为7 033 bp的Go AstV全基因组序列。采用Meg Align分析的核苷酸同源性结果显示，4株Go Ast V全基因组序列的同源性为98.4%～99.4%，与报道的Go AstV-2参考株全基因组序列的同源性为97.1%～99.7%，而与Go AstV-1全基因组序列的同源性仅为57.3%～57.7%。与其他禽星状病毒相比，Go AstV与火鸡星状病毒2型(TAstV-2)的同源性最高，其全基因组序列同源性约为65.0%～65.3%。Cap蛋白的氨基酸序列分子特征分析结果显示，4个鉴定株Cap蛋白的氨基酸序列均发生了Y36H突变，其中Go Ast V/Guangdong/...     

新型鹅星状病毒现地株的分离鉴定

为了解齐齐哈尔地区新型鹅星状病毒（Goose Astrovirus,GAstV）的流行情况,本试验采用从查哈阳农场某养殖场采集的疑似新型鹅星状病毒感染致死的雏鹅肝脾病料,进行病毒分离培养,对获得的病毒尿囊液进行RT-PCR检测、病毒半数致死量测定、血凝性检测及动物回归试验。结果表明：分离到的病毒株能使12日龄鹅胚在144 h内死亡;测定病毒的半数致死量（EID50）为10～3.5;血凝性检测未检测出血凝价;动物回归试验,可复制该病,致使5日龄雏鹅发病死亡;ORF1b基因R T-PCR扩增条带大约为210 bp,与目的条带大小相符;对其进行核苷酸序列比对,与在NCBI上已发表的新型鹅星状病毒核苷酸同源性高达99.64%。说明该分离株为新型鹅星状病毒毒株。     

导致雏鹅痛风新型鹅星状病毒的分离鉴定

2017年2-12月,我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群暴发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于5~20日龄的雏鹅,病鹅内脏器官及关节腔发生严重的尿酸盐沉积,死亡率最高可达50%,给养鹅业造成了巨大的经济损失。为确定引起该病的病原,本试验对在全国各地采集的143份样品进行了实验室检测及病原的分离鉴定。检测结果显示,禽星状病毒阳性检出率达96.5%(138/143)。对山东平原分离株(SDPY株)ORF1b基因进行了遗传进化分析,结果表明该分离株与已报道的鸡源、火鸡源、鸭源及鹅源星状病毒亲缘关系较远,核苷酸同源性仅为49.5%~67.7%。动物回归试验结果显示,1日龄健康雏鹅于接种SDPY株24h后陆续死亡,剖检表现为心脏、肝脏、肺脏、肾脏等内脏器官及关节腔的尿酸盐沉积与肾脏的出血肿大,与自然发病症状一致。由此确定,导致雏鹅痛风病的病原为新型鹅星状病毒。     

2株鸭源新型鹅细小病毒分离鉴定及遗传进化分析

为更好地了解能引起鸭短喙侏儒综合征(SBDS)的新型鹅细小病毒(NGPV)的遗传变异特性,对从湖北地区采集的病样进行病原检测,经鸭胚接种成功分离到两株NGPV,分别命名为HBXY07和HBWH07,并对其进行全基因组序列分析和重组鉴定.全基因组系统发育树和序列比对表明水禽细小病毒主要有两个分支,分别为GPV和MDPV,...     

1株新型鸭呼肠孤病毒(SL株)的全基因组测定分析及其致病性

为明确我国川渝地区鸭疑似呼肠孤病毒病的致病原,本试验对患病鸭进行病毒的分离、鉴定、全基因组测序分析及致病性试验。首先针对临床肝脾肿大、出血坏死为主要特征的病例,利用鸭胚传代法进行病毒的分离,结合RT-PCR方法鉴定分离毒株;其次利用二代测序技术对分离毒株进行全基因组测序,利用MEGA X软件对序列进行比对和分析;最后将分离毒接种7日龄健康雏鸭,观察其病死率及肝脏、脾脏组织的病理变化。结果发现F6代病毒能够稳定适应鸭胚,RT-PCR鉴定为呼肠孤病毒,对鸭胚的半数致死量(ELD₅₀)为10^-5.32/0.2 mL,分离毒命名为SL株。全基因测序显示该毒株全长23 580 bp, GC含量49.62%,共分10个节段,分别为L1～L3、M1～M3和S1～S4(GenBank登录号：MW196679～MW196688)。序列分析显示SL株与新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus, NDRV)具有较高的相似性,为87.02%～99.48%;与番鸭呼肠孤病毒(MDRV)的相似性次之,为80.09%～98.77%;而与鸡源呼肠孤病毒(AR...     

Isolation,Identification and Complete Genomic Sequence Analysis of Goose Astrovirus

From October 2017 to May 2019, 67 samples of typical goslings gout were collected from Guangdong, Sichuan, Hebei, Shandong, Anhui, Liaoning provinces and other vast goose-raising areas in China. The results showed that goose astrovirus was detected in all samples and about 94.03% of the samples were infected by two different kinds of goose astrovirus. The pathogenicity of goose astrovirus FLX variant strain (named SCCD) which could stably proliferate in goose embryos and kill 10-day-old goose embryos was more virulent than goose astrovirus FLX strain. The new type of goose astrovirus strain (named SDPD) could't stably proliferate in goose embryos and SPF chicken embryos. The whole genome nucleotides homology of goose astrovirus FLX strain with goose astrovirus SCCD strain and the new type goose astrovirus SDPD strain were 89.7% and 58.1%, the amino acids homology of ORF1b gene were 98.4% and 61.0%, the amino acids homology of ORF2 gene were 81.0% and 42.5%, respectively. The newly isolated goose astrovirus strains were inoculated into 1-day-old healthy goslings, the results showed that although the goose astrovirus SCCD strain and the new type goose astrovirus SDPD strain could cause the death of goslings and the changes of hepatitis, kidney swelling and weight loss, none of the goslings showed typical gout characteristics (urate deposition in the organs of the body), however, 44% of goslings were characterized with typical gout which was consistent with the symptoms of natural disease after coinfected by the two goose astrovirus strains. Therefore, the pathogenic agents of goslings gout may be two different kinds of goose astrovirus, namely the new type of goose astrovirus and the variant of goose astrovirus FLX.     

鹅病毒性肠炎BC07株病毒的分离与鉴定

对采自白城市的疑似鹅病毒性肠炎的病死雏鹅病料,经过病毒分离培养、中和试验、动物回归试验和PCR检测,证明所分离的病毒确为鹅病毒性肠炎病毒。     

Goose haemorrhagic hepatitis caused by a new subtype duck hepatitis type 1 virus

Duck hepatitis type 1 virus (DHV-1) causes a fatal disease in ducklings but there is no report of DHV-1 isolation from goose. Recently, cases of a new disease in overfeeding geese were reported from China. The cases were characterized by haemorrhagic hepatitis lesions on liver after post mortem examinations. The flocks showed about 20-40% morbidity and less than 5% mortality. The histopathological lesions showed destroyed structure of hepatocytic tissue, severe vacuolation and necrosis of hepatocytes. Viral antigen could be detected by monoclonal antibody against duck hepatitis type 1 virus (DHV-1) in the cytoplasm of positive hepatocytes. PCR amplified viral sequences with primers specific for recent Korean-like duck hepatitis type 1 virus (DHV-1C). Alignment of the complete sequence demonstrated that the isolated JT strain from goose exhibiting 95.9% identity to DHV-1C AP-03337 strain, and only 75.3% to classical DHV-1 virus. 80% goslings developed haemorrhagic hepatitis after infection with JT strain. This is the first report on the involvement of a DHV-1 virus in goose.     

小鹅瘟病毒贵州株的分离与鉴定

采用鹅胚接种、动物感染、电镜观察及病原核酸与结构蛋白分析等方法对贵州省某养殖场疑似小鹅瘟病例进行了病原的分离与鉴定.结果:该病例组织病料可使鹅胚呈现特征性病变,雏鹅人工感染后能表现出与自然感染病例相似的症状;电镜下病毒粒子直径为20～25 nm,无囊膜,具有典型细小病毒特征;经1%琼脂糖凝胶电泳,病毒核酸扩增片段约为5100 bp;经SDS-PAGE发现,病毒结构蛋白由3条多肽组成,即VP1、VP2、VP3,分子量依次为88、68、57 ku.实验成功分离得到了一株贵州小鹅瘟病毒流行毒株.     

抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

自2016年以来,鹅星状病毒(GoAstV)已成为当前危害鹅养殖业生产的重要病原体之一,雏鹅均易感,主要引起9～19日龄雏鹅死亡,以雏鹅腿关节肿胀及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎为主要病征.建立相应的病原学与血清学检测方法对于防控该病至关重要.为建立基于病毒Cap蛋白的诊断技术,本研究构建了鹅星状病毒去核定位信号肽的Cap基因...     

鹅副粘病毒病油乳剂灭活苗的研究

鹅副粘病毒病是1997年本组王永坤等首先发现的一种新的鹅烈性传染病，发病率和死亡率分别达27.7%和18.2%。为了控制该病的流行传播，本课题组在研究该病的病原特性和防制方法的基础上，尽快研制了油乳灭活疫苗。从该疫苗的免疫结果观察，疫苗在免疫后第七天即可产生抗体（平均为2^3.9)，15天达到2^6.7，30天可达到2^8.8；从免疫保护试验看，免疫后15天，用强毒攻击，免疫组全部保护，而对照组5只鹅全部发病，3只死亡。从区域性中试调查结果来看，该苗安全、有效，能较好地控制该病的流行。     

小鹅瘟病毒的分离鉴定与临床病变观察

从患病雏鹅的病料样本中分离鉴定出一株小鹅瘟野毒。采用鹅胚扩增病毒。以琼脂扩散试验从感染鹅胚尿囊液中检出小鹅瘟病毒抗原,用感染鹅胚尿囊液人工接种8日龄健康雏鹅,雏鹅表现出典型的小鹅瘟临床症状和剖检特征。     

鹅细小病毒强毒株XKY10株的分离、鉴定及其生物学特性分析

采用电镜观察、PCR检测、血液凝集和琼脂扩散方法来鉴定从白城某养鹅场10日龄雏鹅具有典型症状的雏鹅肝脏、脾脏和肠组织中分离的一株病毒;通过测定此病毒最小致死量致死鹅胚的平均时间(MDT)和鹅胚半数致死率(ELD₅₀)来分析其毒力。鉴定结果表明,该病毒为鹅细小病毒。毒力分析结果表明,该毒株为强毒株。