啮齿动物卵泡颗粒细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡一直是生物学研究的热门课题.卵泡颗粒细胞凋亡引起的卵泡闭锁是卵巢衰退的原因之一,揭示卵泡颗粒细胞凋亡的分子机制有助于降低细胞的凋亡率,延长卵巢寿命.本文对细胞凋亡的过程与调控机制以及影响啮齿类动物卵泡颗粒细胞凋亡的因素进行阐述,为进一步研究细胞凋亡调控机制奠定理论基础.     

生殖激素调节颗粒细胞凋亡的机制研究进展

研究表明颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的重要原因,调控颗粒细胞凋亡的因素是多种的,而生殖激素如生长激素、抑制素、活化素、卵泡抑素等间接地和直接地对卵巢卵泡颗粒细胞凋亡发挥重要的综合调控作用,这些激素通过多种信号转导途径调节颗粒细胞的凋亡,成为卵泡的存活因子和死亡因子.这些途径相互交联,构成信号网络,与卵巢的旁分泌、内分泌、自分泌途径一起参与卵泡闭锁和颗粒细胞的凋亡.     

miRNA调控动物卵泡发育研究进展

雌性动物的繁殖潜力基于卵泡的发育,该过程受到复杂的基因网络调控。microRNA （miRNA）是一种短的、非编码RNA,在转录后调控基因表达。在过去的十年中,对动物卵泡中非编码RNA的深入研究揭示了miRNA在卵泡发育过程中的关键作用。作者简述了雌性动物卵泡发育过程,总结了miRNA调控卵泡发育的作用机制,包括原始卵泡的激活、生长卵泡的发育选择、卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞的生长调控等,分析了卵泡液外囊泡携带miRNA的功能。但当前卵泡miRNA的研究多集中在细胞敲低模型研究,敲除模型研究较少,因此增加细胞及活体敲除模型的研究有助于更好地了解miRNA在卵泡发育中的功能。本综述可为深入解析雌性动物繁殖性状调控的分子机制提供参考。     

颗粒细胞凋亡影响家禽卵泡闭锁的研究进展

卵巢是家禽的重要繁殖器官,会产生大量卵泡,而卵泡在生长发育的各个阶段中都可能因为不同因素的调控而发生闭锁,最终导致繁殖性能衰退。颗粒细胞对卵泡的生长发育有重要调控作用,其凋亡会诱导卵泡发生闭锁。诱导颗粒细胞发生凋亡的因素较多,包括激素、细胞因子、氧化应激、线粒体及其他体外因素。颗粒细胞凋亡主要由线粒体途径导致,其涉及到半胱天冬酶（Caspase）家族参与,当线粒体裂解时会释放细胞色素C （Cyt-C）,随后形成凋亡小体激活Caspase-3和Caspase-8,最终激活Caspase-9导致颗粒细胞凋亡;当颗粒细胞发生凋亡,家禽体内卵泡丧失生物功能并且卵泡细胞之间的调控失衡,促使卵泡内卵母细胞和膜细胞凋亡,最终导致卵泡发生闭锁;颗粒细胞在存活状态下所分泌的生长因子、性腺类固醇、细胞因子能减少卵母细胞氧化损伤,防止细胞内活性氧（ROS）水平过高导致的线粒体DNA损伤,从而避免线粒体功能障碍而造成的颗粒细胞凋亡。作者从颗粒细胞凋亡及其影响因素、颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的关系、颗粒细胞凋亡对卵泡闭锁的影响3个方面进行阐述,以期为减少卵泡闭锁、提高家禽繁殖性能提供理论依据。     

猪卵泡闭锁期间凋亡因子对颗粒细胞的影响

在哺乳动物卵巢中,约有99%的卵泡经历一个"闭锁"的退化过程,在卵泡发育期间仅有少数发育、排卵.多数未知的分子机制(包括细胞死亡配体-受体系统)是控制哺乳动物闭锁卵泡上颗粒细胞凋亡的主要因素,在猪卵巢颗粒细胞的报道中至少有5种细胞死亡配体-受体系统.文章阐述了猪卵泡闭锁期间凋亡因子对颗粒细胞的影响.     

瘦素对水牛体外卵泡颗粒细胞凋亡的影响

为探讨瘦素(leptin)对水牛体外卵巢卵泡颗粒细胞(GCs)凋亡的影响,用三组含不同浓度(10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml)leptin的培养基体外培养水牛卵泡颗粒细胞,以不含leptin的培养基做对照。采用An-nexin V法通过流式细胞仪检测其卵泡颗粒细胞的凋亡率。结果发现leptin浓度在100ng/ml时颗粒细胞凋亡率显著降低,其他浓度组与对照组的凋亡率之间无显著性差异,提示一定浓度的瘦素对卵泡颗粒细胞凋亡有抑制作用。     

鹅卵泡颗粒细胞凋亡及其与生殖激素间的关系

采用正处于产蛋期的扬州鹅10只，取其卵泡分离颗粒层细胞，用70％乙醇固定后，应用流式细胞术分析颗粒细胞凋亡情况。同时，用连续采血的方法，每3h采血一次，分离血浆，用放射免疫分析法测定血浆促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、雌激素（Ez）水平，用以分析激素水平与凋亡间的关系。结果表明：（1）无论是健康卵泡还是闭锁卵泡，颗粒细胞90％以上均处于G1期，2％～6％处于G2期，S期比例最小；（2）闭锁卵泡颗粒细胞凋亡率极显著高于健康卵泡（P〈0．01）；（3）随着健康卵泡直径的增加，颗粒细胞的凋亡呈降低趋势；（4）健康组鹅的FSH、E2水平要高于闭锁组，而LH水平要低于闭锁组。     

辽宁绒山羊卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的研究

采用TUNEL原位法和DNA梯度电泳法等方法对卵巢上闭锁卵泡中凋亡的颗粒细胞类型和分布状况等进行研究.结果表明,辽宁绒山羊闭锁卵泡是细胞凋亡引起的.DNA梯状电泳表明,不同健康程度卵泡颗粒细胞凋亡程度不同;而颗粒细胞TUNEL原位标记表明,健康卵泡、轻度闭锁卵泡及闭锁卵泡中颗粒细胞凋亡比例分别为13.21%±1.23%、32.13%±2.13%、51.31%±3.02%;不同健康程度卵泡中类固醇激素水平不同,健康卵泡中E2水平较高,孕酮浓度较低;闭锁卵泡中E2浓度较低,P4浓度较高,健康、轻度闭锁和闭锁三类卵泡中E2/P4比值分别是2.62±0.03、0.074±0.000 3、0.028±0.000 4.     

镉对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响研究

为探讨镉对雌性生殖机能的影响,幼鼠皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后腹腔注射不同剂量的氯化镉,用琼脂糖凝胶电泳及TUNEL法对卵巢颗粒细胞进行凋亡检测;免疫组织化学法检测颗粒细胞的bax表达。结果显示注射氯化镉后48 h的高、中、低剂量组卵巢颗粒细胞(GC)凋亡率分别为(13.887 1±1.329 9)%、(10.757 3±1.229 3)%(、10.020 8±0.983 7)%,均显著高于对照组(0.637 8±0.387 2)%(P<0.01);96 h对照组GC凋亡率显著升高,高剂量组与其它组间差异明显,中、低剂量组与对照组差异不明显。凝胶电泳仅96 h高剂量组呈现梯状带。48 h、96 h各剂量组bax表达明显高于对照组(P<0.01)。可见镉对卵巢颗粒细胞的凋亡有促进作用,并有一定的剂量相关性;TUNEL法检测细胞凋亡优于电泳法,当细胞凋亡率较低时(<20%),电泳检测不到DNA梯状带;卵巢颗粒细胞凋亡和bax的表达有一定的相关性,随凋亡率的升高bax表达呈上升趋势。     

水牛有腔卵泡颗粒细胞凋亡的生物形态学特征

为了解水牛有腔卵泡闭锁的起因和有腔卵泡中是否存在卵泡颗粒细胞凋亡，本研究选择青春期前水牛和成年（发情间期和发情期）水牛的卵巢，采用石蜡组织切片、HE染色技术进行光镜观察，并采用DNA原位末端标记（TUNEL）技术和透射电镜观察研究了卵泡颗粒细胞凋亡的特征。结果表明：青春期前水牛的健康有腔卵泡上无或仅有极个别凋亡的卵泡颗粒细胞（GCs），而闭锁有腔卵泡上存在有多量凋亡的GCs，凋亡的形式：GCs层内出现单个或多个凋亡细胞，卵泡腔内出现凋亡小体群。在成年水牛发情间期的闭锁大卵泡上，GCs层弯曲皱折，存在多量凋亡的GCs。发情期水牛成熟卵泡的GCs层也存在GCs凋亡，排卵前的GCs层细胞全部脱落到卵泡腔内。本研究首次在同一组织切片上先后分别应用HE染色和TUNEL检查细胞凋亡，且证实了水牛有腔卵泡GCs凋亡的存在。超微结构显示了GCs凋亡的核边集化、核浓缩及凋亡小体的形态。上述结果提示：在水牛闭锁有腔卵泡中存在着GCs凋亡，GCs凋亡是启动水牛有腔卵泡闭锁的潜在机理。     

SMAD7对山羊卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的影响

旨在探究SMAD7对山羊卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的影响。本试验收集3~4月龄大足黑山羊母羊的卵泡颗粒细胞,通过过表达或siRNA干扰、ELISA、qRT-PCR、Western blot及流式细胞术等技术与方法探究SMAD7对颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌的影响。结果发现,SMAD7过表达显著下调颗粒细胞增殖活力并促进细胞凋亡,抑制PCNA表达（P<0.05）,下调BCL2/BAX的比值（P<0.01）;同时,SMAD7干扰显著上调颗粒细胞增殖活力,显著上调PCNA表达（P<0.05）与BCL2/BAX表达量比值（P<0.05）。SMAD7过表达极显著上调颗粒细胞的孕酮分泌,下调雌二醇表达水平（P<0.01）;同时SMAD7干扰极显著下调孕酮分泌,上调雌二醇分泌（P<0.01）。进一步研究发现,SMAD7过表达显著抑制SMAD2、SMAD3的mRNA和蛋白表达（P<0.05）;SMAD7干扰则显著促进SMAD2、SMAD3的mRNA和蛋白表达（P<0.05）。结果表明,SMAD7抑制山羊卵泡颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌,促进凋亡和孕酮的合成,并且抑制SMAD2、SMAD3的表达,进而调节卵泡的发育与闭锁。     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

性未成熟小母猪注射PMSG对卵泡闭锁及颗粒细胞凋亡的影响

为探讨孕马血清促性腺激素 (PMSG)对 2～ 3月龄性未成熟的小母猪卵巢中卵泡发育、卵泡闭锁以及卵泡颗粒细胞凋亡的影响 ,就其注射 PMSG后 2 4、4 8、72、96 h卵巢中各类卵泡数量、颗粒细胞凋亡比例及外周血浆中类固醇激素水平等进行了研究。结果如下 :(1)未注射 PMSG前 ,性未成熟小母猪卵巢表面卵泡总数 (10 .5个 /卵巢 )及各类卵泡数 (小卵泡 9个 /卵巢 ,中等卵泡数 1.5个 /卵巢 )均较少 ;注射 PMSG后 2 4 h,小卵泡数 (2 4个 /卵巢 )、中等卵泡数 (6 .5个 /卵巢 )和大卵泡数 (1.5个 /卵巢 )与对照组相比均明显增多 ;至注射 PMSG后 96 h,小卵泡数 (4.5个 /卵巢 )和中等卵泡数 (1.5个 /卵巢 )均明显减少 ,但大卵泡数量仍较多 (4.5个 /卵巢 )。 (2 )未注射 PMSG前 ,性未成熟小母猪各类卵泡中的颗粒细胞凋亡比例均较高 ,小卵泡和中等卵泡分别为 2 4 .8%和 34.4 % ;注射 PMSG后 2 4 h,颗粒细胞凋亡比例显著降低 (P<0 .0 5 ) ,小卵泡和中等卵泡分别为 10 .7%和 13.7% ;至注射 PMSG后 72 h,小卵泡和中等卵泡的颗粒细胞凋亡比例开始显著升高 (P<0 .0 5 ) ,而大卵泡在出现后颗粒细胞凋亡比例较低且无较大波动。 (3)在未注射PMSG前 ,血清中的雌二醇含量仅为 15 .3ng/L,孕酮则由于含量太低而未能检测到 ;在注射 PM     

FOXO3基因过表达对鹅卵泡颗粒细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响

本研究首先克隆鹅FOXO3基因编码区(CDS)序列,构建FOXO3基因的真核表达载体,然后将其转染至鹅卵泡颗粒细胞中,利用荧光定量PCR方法检测FOXO3基因对细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响。结果显示,本研究成功克隆了鹅FOXO3基因CDS序列,并由此构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXO3。鹅卵泡颗粒细胞FOXO3基因过表达实验发现,过表达组凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Fasl的mRNA表达水平较对照组均升高(P<0.05),而自噬相关基因LC3和Beclin1的mRNA表达水平较对照组均降低(P<0.05)。本研究结果表明,FOXO3基因可能影响鹅卵泡颗粒细胞中凋亡及自噬相关基因的表达,进而调控颗粒细胞的凋亡和自噬。     

绵羊miR-127/FOXO4反馈环路及其对卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响

旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。     

褪黑素对体外培养绵羊卵泡颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响

采集绵羊卵泡颗粒细胞进行体外培养,根据试验设计加入褪黑素(MLT)和HCG,分别于不同培养时间收集细胞培养液,用放射免疫测定法(RIA)测定细胞培养液中雌二醇(17β-E2)和孕酮(P4)含量。结果表明:卵泡颗粒细胞在无血清培养体系中可体外培养,并能够分泌相应17β-E2;用MLT或MLT与HCG共同处理卵泡颗粒细胞,能促进细胞分泌17β-E2,并呈时间和剂量的依赖性,但对P4的分泌没有影响。