向日葵柄锈菌效应子P2的定位及功能研究

由向日葵柄锈菌（Puccinia helianthi Schw.）引起的向日葵锈病严重威胁着向日葵的安全生产。效应子是一类病原菌侵染过程中分泌的蛋白，促进病原菌侵染或触发寄主免疫。为明确向日葵锈菌效应子P2在锈菌侵染过程中发挥的作用，对该基因序列进行了生物信息学分析；以向日葵锈菌夏孢子cDNA为模板，克隆了P2基因的编码序列，利用qRT-PCR技术分析了该基因在侵染过程中的表达特性；采用农杆菌瞬时表达系统在烟草上验证了P2的毒性功能，并在烟草上瞬时表达对其进行了亚细胞定位。研究结果表明，P2编码58个氨基酸，N端含24氨基酸的信号肽，无核定位信号及跨膜结构域，并在向日葵锈菌侵染早期上调表达。在本氏烟中瞬时表达P2可以抑制BAX诱导的细胞坏死，亚细胞定位结果表明P2定位在细胞膜及细胞核。     

小麦TaCTSB基因在小麦-条锈菌互作中的功能研究

为明确小麦组织蛋白酶B基因TaCTSB在小麦与条锈菌互作中的功能,采用PCR技术扩增获得TaCTSB基因的完整编码区序列;通过qRT-PCR技术检测TaCTSB基因的表达情况;利用农杆菌介导瞬时表达体系在烟草叶片上进行亚细胞定位,并验证其是否能够诱导细胞坏死;利用VIGS技术瞬时沉默TaCTSB,解析其对小麦与条锈菌互作的影响。结果表明,TaCTSB基因编码344个氨基酸,N端含有1~19 aa的信号肽,无跨膜结构;qRT-PCR结果显示,TaCTSB基因在小麦与条锈菌非亲和互作早期上调表达。瞬时表达分析发现,烟草叶片上瞬时表达TaCTSB基因能够诱导细胞坏死,且质壁分离后TaCTSB分泌到细胞外。在TaCTSB瞬时沉默植株上接种条锈菌毒性小种CYR31,产孢量变化不显著;而接种条锈菌无毒性小种CYR23,产孢量升高;组织细胞学观察发现,在小麦叶片中瞬时沉默TaCTSB,其活性氧面积和坏死面积显著下降,菌丝面积及菌丝长度均有所增加,表明沉默TaCTSB减弱了小麦对条锈菌的抗性。     

向日葵锈病抗性相关microRNA的挖掘及其靶基因预测

前期利用高通量测序技术及生物信息学分析方法,在向日葵上预测筛选到10个差异表达的新microRNA （miRNA）可能与锈病抗性相关。本试验利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术,对筛选到的10个miRNA做进一 步的定量验证。结果表明,相比于水处理的健康叶片(对照组A),接种锈菌300生理小种的叶片中（抗病组B）HanmiR21 、Han-miR25、Han-miR42表达量呈上调趋势,Han-miR11、Han-miR34、Han-miR43、Han-miR47、Han-miR67 表达量呈下调趋势;接种锈菌737生理小种的叶片中（感病组C）Han-miR25、Han-miR42的表达量呈上调趋势, Han-miR11、Han-miR21、Han-miR34、Han-miR43、Han-miR47、Han-miR67表达量呈下调趋势。qRT-PCR的检测 结果与前期高通量测序结果80%相一致。利用miRanda软件预测靶基因,10个miRNA共预测到117个靶基因,其 中86个靶基因获得其生物信息学功能注释。运用miRBase数据库,对10个新预测miRNA进行同源性分析发现,新 预测的10个miRNA与拟南芥、烟草、水稻等作物中参与病害逆境胁迫响应的miRNA有较高相似性（62%～100%）。 定量检测和验证miRNA作用的靶基因时发现,抗病组表达量上调的Han-miR21对应的靶基因有1个下调、表达量 下调的Han-miR43对应的靶基因有3个上调,符合miRNA与其靶基因互作的规律。     

小麦条锈菌效应蛋白Hasp58抑制植物免疫的功能分析

为明确小麦条锈菌吸器特异表达效应蛋白Hasp58抑制植物免疫的功能,利用PCR获得Hasp58的全长cDNA序列;借助生物信息学软件预测Hasp58的信号肽;将Hasp58构建到pGR106载体用于农杆菌（Agrobactrium tumefacien）介导的烟草瞬时表达系统,明确Hasp58抑制细胞坏死的毒性功能;将Hasp58构建到pCambia1302载体用于烟草细胞定位,明确Hasp58定位情况;将Hasp58构建到pEDV6载体用于荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）介导的小麦瞬时表达系统,对小麦胼胝质、过敏性坏死面积、活性氧、菌丝面积、菌丝长度进行统计分析,明确Hasp58抑制寄主植物PAMPs引发的免疫反应（PTI）和效应蛋白诱导的免疫反应（ETI）功能。结果表明,条锈菌Hasp58的cDNA全长为1 026 bp,编码342个氨基酸,N端含26_aa的信号肽;通过农杆菌侵染,在烟草中瞬时表达Hasp58,发现其能够抑制由BAX诱导的细胞坏死,为条锈菌的候选效应蛋白;烟草细胞定位发现,含有信号肽和缺失信号肽的Hasp58与GFP融合表达均定位在细胞质,推测该效应蛋白在胞质作用;利用细菌的三型分泌系统在小麦中瞬时表达Hasp58,发现其能够抑制荧光假单胞杆菌引起的胼胝质积累,导致由无毒性条锈菌小种CYR23引起的小麦过敏性坏死面积和活性氧减少,使菌丝面积和长度增加。推测小麦条锈菌效应蛋白Hasp58可抑制寄主植物的PAMPs引发的免疫反应（PTI）和效应蛋白诱导的免疫反应（ETI）,并促进自身侵染。     

多个稻曲病菌效应因子的信号肽验证和表达分析

【目的】信号肽对效应因子的分泌至关重要,影响病原微生物的致病进程。前期鉴定到在稻曲病菌侵染水稻花器官过程中显著上调表达的10个效应因子基因,但这些效应因子是否含有功能性信号肽及其表达模式尚不明确。【方法】利用SignaIP-5.0数据库预测、烟草瞬时表达系统和酵母信号肽分泌实验,分析并鉴定这些效应因子的信号肽。利用实时荧光定量PCR技术,检测效应因子基因的表达模式。【结果】UV＿44、UV＿1548、UV＿1567等10个稻曲病菌效应因子均含有信号肽。烟草瞬时表达结果显示,含有信号肽的eYFP融合蛋白在细胞质壁分离后均能分泌到质外体空间。酵母菌信号肽分泌结果显示,分别携带这10个信号肽的酵母菌株可在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长,且与TTC发生显色反应。实时荧光定量结果表明,除了UV＿6754,其余9个效应因子基因的表达模式不尽相同,其中UV＿44、UV＿1567、UV＿3667、UV＿4213、UV＿4989、UV＿5215和UV＿8184的表达量在接种后显著升高。【结论】这10个稻曲病菌效应因子均含有分泌功能的信号肽,编码效应因子的基因在稻曲病菌侵染过程中具有不同的表达模式。该结...     

向日葵NBS-LRR抗病基因家族全基因组分析

利用生物信息学方法对向日葵基因组的蛋白质数据库进行搜索,共获得255个富含亮氨酸的重复序列和核苷酸结合位点(nucleotide binding site and leucine rich repeat,NBS-LRR)类抗病基因的蛋白质序列,并根据结构域类型,将其分为TIR和Non-TIR两类。进一步对其中42个同时含有LRR和NBS结构域的LRR-NBS型基因编码蛋白质的理化性质、氨基酸序列及基因在染色体上的物理分布进行分析,结果表明,基因多分布于4号、8号和13号染色体,而且52.4%以基因簇存在;结构域预测结果显示,该类蛋白都具有特征结构域NBS结构域,氨基酸序列同源性为29.26%。对6个NBS类基因经向日葵锈菌诱导后的表达分析表明,6个基因均可被向日葵锈菌诱导表达,说明其可能参与了向日葵响应锈菌胁迫的抗病反应过程。     

寡糖诱导向日葵抗锈病的信号转导途径

为了解寡糖诱导向日葵抗锈病过程中的信号转导途径,利用寡糖、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）预先喷雾处理向日葵叶片,1d后接种锈菌,通过对植株体内脂氧合酶（LOX）活性及SA含量的测定,并通过RT-PCR对SA、JA信号途径的标记基因PR5和PDF1.2等表达水平进行测定,初步确定诱导抗性表达的信号转导途径。结果表明：经寡糖诱导后,向日葵叶片内LOX活性降低,SA含量上升,且诱导水杨酸途径标记基因PR5表达量增加。结果说明寡糖诱导向日葵抵抗锈病主要与SA介导的信号途径有关。     

向日葵锈菌胞外金属蛋白酶的特性分析

为进一步了解锈菌侵染向日葵的致病机制,对向日葵锈菌(Puccinia helianthi)分泌的一种新型的金属蛋白酶(metalloproteinase,Mep)水解活性和生物学特性进行了表征。使用偶氮酪蛋白法测定蛋白酶的活性,在波长280 nm下测吸光度。结果表明,该蛋白酶对偶氮酪蛋白具有水解活性,纯酶最适温度和pH分别是50℃和7.0,在pH 5.0～9.0和温度50℃以下保持稳定。蛋白酶受到抑制剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、1,10-菲咯啉的显著抑制;Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺可以显著提高该蛋白酶的活性,表明该酶为金属蛋白酶。另外,利用qRT-PCR试验测定了基因Mep在锈菌侵染向日葵的过程中的表达情况,结果显示,在接菌48 h时,基因表达量达到高峰,后逐渐降低,表明该蛋白酶参与了锈菌对向日葵的早期侵染过程。     

向日葵锈菌夏孢子转录组微卫星特征分析

为大规模开发有效的向日葵锈菌SSR标记,根据向日葵锈菌转录组数据,使用Ubuntu 12.04 LTS系统的Perl操作平台MISA软件对向日葵锈菌转录组序列进行高通量微卫星SSR位点发掘。在15 946条转录本中发现20 861个SSR,平均3.97kb出现一个SSR。共发现244种碱基重复模式,(A/T)n所占比例最高,达到88.24%。在42 610条注释成功的向日葵锈菌unigene中,含有SSR的序列14 069条,共发现18 100个SSR位点,其中位于编码区1 057个,出现频率为0.382 2 SSR/kb,非编码区为0.300 1 SSR/kb;其中以单核苷重复基序为主导,共有19 046条,占总SSR的59.5%;其次是三碱基微卫星(804,占3.86%)。大部分微卫星长度小于20bp,长度大于20bp的仅占7.37%。研究结果显示,微卫星与基因平均表达水平存在关联,含微卫星基因的平均表达水平低于不含微卫星基因的平均表达水平。包含SSR的15 946条unigene中只有5 863个unigene获得了GO分类号,被注释到分子功能、生物进程、细胞组分三大本体。通过生物信息学软件得到的转录组SSR标记位点可用于后续向日葵锈菌遗传多样性研究,而且对其他非模式生物或新物种SSR标记开发也具有重要的参考作用。     

巴西橡胶树HbRD22基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术从低温诱导的巴西橡胶树全长cDNA文库中获得了HbRD22基因,该基因全长1 458 bp。生物信息学分析结果表明,HbRD22编码一个由338个氨基酸组成的、相对分子量为36.96 ku、等电点为7.65的多肽,并含有一个由217个氨基酸组成的BURP结构域。其推导的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达69%。信号肽预测结果表明HbRD22蛋白为分泌型蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽区域。Northern blotting分析结果表明,该基因在正常生长情况下,表达水平较高,干旱胁迫后24 h,表达量逐渐减低,直至检测不到,揭示该基因受干旱胁迫负调控。     

田间向日葵品种籽粒锈斑发生程度比较

向日葵籽粒锈斑病又称“水锈病”，是近几年向日葵生产上出现的一种新病害，严重影响向日葵籽的商品性，制约着产业的发展。本研究在向日葵籽粒锈斑发生严重的内蒙古巴彦淖尔市乌拉特前旗先锋镇和五原县新公中镇试验点调查取样，评价了44份向日葵品种（39份食葵品种与5份油葵品种）的籽粒锈斑抗性，结果表明：乌拉特前旗试验点供试食葵品种中，只有赛瑞1号单盘平均籽粒锈斑率低于25%；另外共有6份品种（包括JK103、LJ188和LD5009等），单盘平均籽粒锈斑率介于25%~50%之间；其余品种的单盘平均籽粒锈斑率都在50%以上。就严重度而言，共有20份品种籽粒锈斑的严重度鉴定为1级，但是其平均籽粒锈斑率却介于17.30%~88.63%之间；其余品种的严重度均为2级以上。五原试验点的调查结果表明，供试向日葵品种的单盘平均籽粒锈斑率介于61.02%~99.63%之间，均显著高于乌拉特前旗试验点相同品种的调查结果；但是就严重度而言，只有10份品种籽粒锈斑的严重度为1级，以3638C为代表。而供试的5份油葵品种中，除了XKS2029外，其余4份品种的单盘平均籽粒锈斑率均低于25%。同时，不同播种时间下同一品种的籽粒锈斑发生程度也呈现出明显的差异，如SH361品种单盘平均籽粒锈斑率从5月27日播种的34.49%上升到6月20日的98.47%；相应的严重度也从1级上升到4级，说明播期不同对籽粒锈斑发生程度也有明显的影响。     

向日葵抗锈病基因同源序列的克隆与分析

向日葵锈病严重影响向日葵的产量。为了找到抗锈病相关基因,根据已知NBS-LRR型抗病基因保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,以接菌的抗病向日葵品种CM29叶片的cDNA为模板进行扩增。通过克隆转化得到10个具有连续开放阅读框的RGA,经系统进化分析将其分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两种类型。对其氨基酸序列进行多重序列比对结果显示所获得的RGA具有典型的NBS-LRR型抗病基因保守结构域即P-loop、kinase-2a、kinase-3a和GLPL结构。运用BLASTX分析这些结果,表明其RGA与已知的抗病基因相应保守区域的同源性为18.1%～51.1%,说明它们可能与抗病功能基因具有密切联系。     

基于BSA-Seq技术鉴定大豆耐荫性状相关候选基因

间套种是我国南方大豆种植的重要模式，而高秆作物的遮荫胁迫导致大豆产量和品质难以提升，是制约大豆间套种发挥潜力的限制因素，因此对大豆耐荫性的解析尤为重要。本研究以强耐荫材料矮脚早和极不耐荫材料齐佩华为亲本构建RILs群体，根据耐荫指数表型鉴定RIL群体的耐荫性，从RIL群体中挑选出强耐荫和极不耐荫家系各30个，分别构建成两个极端性状DNA子代混合池，对子代混合池和亲本池分别开展平均60×和30×覆盖深度的全基因组重测序，通过计算两个子代池的SNP-index，比较SNP-index在耐荫池与不耐荫池染色体各区段的差异，定位耐荫性状的关联区域；根据基因注释信息，预测候选基因。结果表明4个样本共得到11 963 077个单核苷酸多态性（SNPs）标记，发现控制耐荫相关性状的基因主要集中在1号染色体51 942~505 708 bp区段、4号染色体50 972 768~51 854 631 bp区段、9号染色体48 778 767 ~50 178 743 bp区段和18号染色体40 858 027~43 909 456 bp区段内，共包含408个基因，通过基因注释和功能分析发现ACC氧化酶5、生长素诱导蛋白5NG4、光敏色素相关丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、转录因子MYBJ6和MYB128等5个基因可能在大豆耐荫过程中起着重要作用，确定为大豆耐荫性的候选基因。本研究结果将为解析大豆耐荫的分子机理奠定重要的基础，同时为大豆耐荫基因的图位克隆奠定坚实的理论基础。     

小麦主要农艺性状及抗病性的灰色关联度分析

应用灰色关联度分析方法,对云南省小麦良种区域试验中23个品种(系)6个主要农艺性状(生育期、基本苗、株高、有效穗、穗粒数、千粒重)及2个常发性病害(条锈病、白粉病)与产量的关联度及相互间关系进行分析。结果表明:与小麦产量密切相关的性状依次是有效穗(r=0.797 8)生育期(r=0.752 7)基本苗(r=0.719 7)穗粒数(r=0.715 3)白粉病(r=0.697 9)千粒重(r=0.678 9)条锈病(r=0.670 6)株高(r=0.649 0)。根据小麦主要农艺性状间的关系,对产量影响最大的有效穗与生育期、基本苗关系最密切,其后依次是白粉病、条锈病、穗粒数、千粒重、株高。说明在小麦新品种区域试验中,在保证基本苗较一致的前提下,应重视具有白粉病和条锈病综合抗性的品种,注重选择生育期适当偏长、有效穗多、穗粒数多、千粒重高的小麦新品种(系),同时不要忽略对株高的选择。     

湘油15 PGIP9蛋白基因的克隆和蛋白序列结构分析及原核表达

运用生物信息学软件对湘油15 PGIP9基因的核苷酸、蛋白氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测.结果表明:湘油15 PGIP9编码区CDS长1011 bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,分子量为37.5kDa,等电点为7.9.N端1～22个氨基酸是信号肽,且这一区域疏水性较强,具有5个潜在的N-糖基化位点.N端和C端还各具有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基.二级结构显示有11个α-螺旋,14个β-延伸和25个无规则卷曲.中心LRR结构域由6个串联的LRR基序组成.随后将PGIP9的CDS序列亚克隆到原核表达载体pET -32a(+)中,构建pET - 32a - PGIP9重组表达质粒,并转化E.coil BL21(DE3),25℃,终浓度为0.2 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导2h,都成功的表达了融合蛋白pET - 32a - PGIP9,其分子量约为52kDa,发现主要以包涵体形式存在.没有可溶形式的蛋白表达.     

寡糖对向日葵锈菌侵染的影响

为了明确寡糖对向日葵锈菌侵染的影响,在向日葵苗期用寡糖处理并接菌后对锈菌夏孢子的萌发率和侵入率以及气孔开闭进行了观察,并用甲苯胺蓝染色法对入侵位点酚类化合物的积累进行了检测。试验结果表明,与对照相比寡糖处理后锈菌夏孢子的萌发率和侵入率均显著降低,而气孔关闭率显著升高。同时,在接种后12 h时,大量的侵入位点产生了酚类化合物的积累,说明寡糖处理可以有效抑制向日葵锈菌的侵染。     

基于主成分分析的保靖黄金茶加工过程中氨基酸动态变化研究

以茶树品种保靖黄金茶1号为材料,研究了品质成分氨基酸总量及游离氨基酸组分在加工过程中的动态变化。结果表明,氨基酸总量呈“M”形双峰变化趋势,但产品的含量要高于鲜叶;SPSS主成分分析表明,加工过程中氨基酸总量的变化与天冬氨酸（Asp）和亮氨酸（Leu）变化呈极显著正相关,与茶氨酸（Theanine）呈显著正相关;与丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）呈显著负相关。同时,18种游离氨基酸对氨基酸总量变化的影响可分为3个主成分,第一主成分为天冬氨酸（Asp）、异亮氨酸（Ile）、茶氨酸（Theanine）、缬氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）7种氨基酸;第二主成分为甲硫氨酸（Met）;第三主成分为谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、亮氨酸（Leu）、半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）;三个主成分的累积方差达到99．46％,可以解释加工过程中氨基酸的动态变化过程。     

一种快速检测向日葵地块土壤中黄萎病菌微菌核的新方法

由大丽轮枝孢菌侵染引起的向日葵黄萎病是一种重要的土传病害,微菌核是该病害主要的初侵染来源。目前,土壤中大丽轮枝孢菌微菌核的定量检测方法多操作步骤复杂繁琐,如利用PCR方法进行检测,对仪器设备和操作人员的素质都有较高的要求,而常规的土壤梯度稀释湿筛法的实验周期长且检测效率低,因此,建立一种快速定量检测土壤中大丽轮枝孢菌微菌核的方法,对于向日葵黄萎病的预报预测和防控非常重要。为了能够快速的定量检测土壤中微菌核的数量,以期探明不同耕作方式地块中土壤微菌核数量的差异,本实验建立了一套操作相对简单,实验周期较短的微菌核快速分离和定量检测的方法,即采样器—干筛法。该方法将微生物采样器和选择性培养基相结合,基于微生物采样器的撞击法原理,使土壤微生物粒子加速撞击到选择性培养基的培养皿表面,经培养后可见单菌落形成。利用该方法对内蒙古巴彦淖尔市不同的向日葵黄萎病发病地块中采集到的土壤样本中微菌核进行了定量检测,结果表明：两年向日葵连作地（样地1）土壤中微菌核的数量最多,平均每克土样中含有微菌核32.80个;与非寄主作物玉米轮作地块（样地2）土样中微菌核的数量最少,平均每克土样中含有微菌核11.80个,与寄主作物打籽葫芦轮作地块（样地3）微菌核数量介于二者之间。利用该方法能够明显区分不同地块土壤中微菌核的数量。通过和荧光定量PCR检测的结果进行相关性分析发现,该方法能够准确检测土壤中大丽轮枝孢菌微菌核的数量。