云南撒坝猪源大肠杆菌优势血清型强毒力岛的检测及其致病性

为研究撒坝猪大肠杆菌强毒力岛(HPI)的致病性,对撒坝猪致病性大肠杆菌进行了分离和血清型鉴定,获取优势血清型,采用PCR检测HPI,进行同源性比较,并通过耐药性试验和致病性试验对分离菌株与HPI的相关性进行分析。结果显示:分离得到101株大肠杆菌,确定血清型84株,其中O_3、O_4、O_(24)为优势血清型;HPI阳性率为88.64%,与GenBank登录的参考序列同源性比较大于99.3%;氨基糖苷类药物耐药性试验结果显示分离菌株普遍耐药,而HPI阳性株耐药性强,并检出含aac(3)-Ⅱa基因12株,含有aac(6′)-Ⅰb基因21株;致病性试验表明含irp2的菌株致病性强,而具有fyuA-irp2基因簇的菌株致病性更强。结果表明:HPI对大肠杆菌的毒力有增强作用。     

致病性大肠杆菌HPI毒力岛及其水平转移的研究进展

致病性大肠杆菌作为肠杆菌科成员和人兽共患病病原体之一,在一定条件下可通过多种途径引起人和动物感染并引发不同的大肠杆菌病病型。由于致病性大肠杆菌的血清型和毒力因子众多、耐药趋势严峻、存在生物被膜等因素导致大肠杆菌病的流行趋势复杂且疫苗研发困难,给国内外的畜禽养殖业带来一定的经济损失。高致病性岛(high-pathogenicity island, HPI)最早发现于耶尔森菌,被证实是其毒力表型所必需的基因组岛,为强毒力岛。由于细菌的水平转移机制让该毒力岛在其他肠杆菌科中被广泛检出。其中HPI毒力岛也在致病性大肠杆菌如肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage Escherichia coli,EHEC)、产志贺毒素大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)等中被大量检出,被证实影响致病性大肠杆菌毒力,参与致病性大肠杆菌铁元素摄取和介导宿主免疫反应等。为进一步了解HPI毒力岛在致病性大肠杆菌中的铁元素调控机理、致病特性、介导的细胞免疫反应和水平转移途径,现从HPI毒力岛结构、如何调控耶尔森菌素铁载体、HPI毒力岛致病性及调控细...     

银川地区鸡源致病性大肠杆菌耶尔森菌强毒力岛相关基因的检测及序列分析

为了研究耶尔森菌强毒力岛(HPI)在银川地区鸡源致病性大肠杆菌中的分布情况,试验根据HPI相关基因irp2和fyuA的参考序列设计引物,采用双重PCR方法对分离的20株鸡源致病性大肠杆菌进行这两种基因的扩增和检测,以及基因克隆和核苷酸序列分析。结果表明:irp2和fyuA基因在鸡源致病性大肠杆菌分离株中的阳性率均为40%(8/20);这两种毒力岛相关基因的核苷酸序列与GenBank中报道的基因核苷酸同源性高达98%以上。说明irp2和fyuA基因具有较高的保守性。     

皖北地区仔猪源大肠杆菌毒力因子及HPI毒力岛的检测

我国皖北地区哺乳仔猪腹泻频发,临床直肠棉拭子培养物有34例符合大肠杆菌特征,并进行产肠毒素大肠杆菌(ETEC)毒力因子(STa、STb、LT、SLT-2e)和HPI毒力岛的PCR快速检测。结果,仅有10例表达STa和STb(29.41%),其中3例表达STa基因(8.82%),2例表达STb基因(5.88%),2例表达STa和STb基因,1例表达STa和irp2基因(2.94%),2例表达STa和STb及irp2基因,揭示HPI+大肠杆菌与ETEC混合感染共有3例(8.82%);未检测到LT和STL-2e毒力因子。有10例表达irp2基因(29.41%),其中7例独立表达irp2基因(20.59%)。STa、STb和Irp2的PCR产物测序结果分别与GenBank检索的目标序列比对,其同源性均达到100%。结果初步揭示了皖北地区致哺乳仔猪腹泻ETEC毒力因子及HPI毒力岛的分布情况。     

禽致病性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分子流行病学调查

为了解耶尔森菌强毒力岛（HPI）在禽致病性大肠杆菌（APEC）中的流行情况，根据HPI结构基因irp2和fyuA参考序列设计了引物，用PCR方法和斑点杂交法对从江苏等地分离的APEC基因组进行了扩增和检测，并对E．coli NTJC040406菌株相关基因进行了克隆和序列分析。结果表明，216株APEC中有44．9％的菌株携带有HPI，序列分析表明相关基因与GenBank中参考序列的同源性高达98％以上。提示HPI在APEC中广泛存在，经进一步分析，发现分离菌株是否携带HPI与O78等特定血清型有一定的相关性。     

禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(High pathogenicity island HPI)流行情况和基因特征,根据Gen Bank已知禽源irp2基因序列,设计、合成一对特异性引物,建立irp2基因PCR检测方法,优化、确定PCR扩增特性,进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示,建立的PCR检测方法敏感性可达2.14×10~(-4)ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测,变异系数3.4%~5.0%。256份临床样品PCR检测irp2基因,阳性率30.6%。获得了9株分离株irp2基因序列,分析显示,与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。     

鸡源大肠杆菌中HPI和LEE毒力岛相关基因的检测

采用PCR方法检测辽宁锦州地区分离的150株鸡源大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛基因(HPI)和肠细胞脱落位点毒力岛(LEE),利用多重PCR方法检测HPI irp2和fyuA基因,以及LEE ler和eaeA基因.在分离的鸡源大肠杆菌中,HPI毒力岛基因检测结果为:18.7％的菌株irp2和fyuA基因扩增阳性,6.7％的菌株irp2基因阳性;LEE毒力岛基因检测结果为:15.3％的菌株ler和eaeA基因扩增阳性.结果表明,25.3％的鸡源大肠杆菌携带HPI,15.3％的鸡源大肠杆菌携带LEE.     

致病性大肠杆菌HPI对Caspase-1细胞焦亡相关分子表达的影响

为研究云南撒坝猪致病性大肠杆菌高致病性毒力岛（HPI）致猪源巨噬细胞焦亡的分子机制,本试验以云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI阳性株感染猪源巨噬细胞为切入点,从云南楚雄州某规模养殖场采集撒坝猪仔猪黄白痢的粪便,对大肠杆菌进行分离纯化,并通过PCR技术对HPI irp2基因进行检测,分别以HPI阳性株（HPI⁺）和阴性株（HPI^-）感染巨噬细胞,并设立LPS+ATP组和空白对照组,于0.5和6 h收集各组细胞及其上清。应用实时荧光定量PCR法检测不同组Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平的变化;应用ELISA检测细胞上清pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18含量的变化。结果显示,试验成功分离得到致病性大肠杆菌,经PCR检测成功获得HPI irp2基因阳性株,经实时荧光定量PCR法检测后发现HPI⁺组、HPI^-组与空白对照组相比,Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA表达水平均呈上调趋势,且HPI⁺组高于HPI^-组。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,HPI⁺组和HPI^-组pro-IL-1β、pro-IL-18、IL-1β和IL-18的蛋白表达量普遍呈上调趋势,且HPI⁺组均高于HPI^-组。结果表明,云南撒坝猪致病性大肠杆菌HPI可通过上调猪源巨噬细胞中Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的表达量促进猪源巨噬细胞炎性因子IL-1β和IL-18的释放,诱发炎症,最终促进猪源巨噬细胞发生细胞焦亡。     

猪β防御素-2对猪源肠外致病性大肠杆菌的体内外抑菌活性研究

本研究旨在评价猪β防御素2（porcine beta defensin 2,PBD-2）在体内外对猪源肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）的抗菌效果,为评估PBD-2在抗生素替代品中的应用前景提供参考。首先,在体外检测不同浓度PBD-2对猪源ExPEC PCN033的杀菌活性。随后,选取5周龄,体重在18~22 g之间的雌性昆明小鼠,检测PBD-2处理组和PBS对照组小鼠（n ≥ 5）感染不同剂量的ExPEC PCN033后的存活率,脑、脾脏、肺脏组织和血液中的载菌量、炎性细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、IL-12、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平及脑、脾脏、肺脏组织的病理变化程度。结果表明,PBD-2在25 μg/mL时即可在体外极显著抑制猪源ExPEC PCN033的生长（P<0.01）,且抑制作用随PBD-2的浓度升高而增强。在体内,与PBS对照组相比,PBD-2处理有效降低了小鼠感染不同剂量ExPEC PCN033后的死亡率。提高PBD-2的治疗剂量对降低小鼠死亡率的效果更加明显。腹腔注射和肌内注射的方式在PBD-2降低小鼠死亡率的效果方面优于口服途径。PBD-2治疗在降低小鼠死亡率的效果方面略低于氯霉素治疗。同时,PBD-2治疗极显著降低了小鼠感染ExPEC PCN033 21 h后的脑、脾脏、肺脏组织和血液中的细菌载量（P<0.01）,降低了血液中的IL-6、IL-12和IL-1β的含量（P<0.01）,减轻了脑、脾脏和肺脏组织的病变程度。上述结果说明PBD-2在体外具有良好的抗猪源ExPEC的活性,同时在小鼠体内对猪源ExPEC感染具有治疗作用,表明PBD-2具有开发成为治疗性药物或者抗生素替代品的潜力。     

犊牛肺源致病性大肠杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

研究旨在鉴定引起犊牛呼吸系统疾病的细菌性病原,选择38份采集自阿克苏地区某规模化牛场病牛病料组织,进行细菌分离鉴定、16S rRNA基因鉴定、动物试验以及PCR扩增等.结果显示,分离株对营养要求很低,在麦康凯琼脂培养基上形成粉红色、边缘整齐、表面光滑湿润的菌落;在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属光泽的菌落;综合生化试验结果...     

树鼩源大肠杆菌分离鉴定及耶尔森强毒力岛相关基因的检测及序列分析

【目的】 研究树鼩源大肠杆菌耶尔森强毒力岛（HPI）相关基因的携带情况及其耐药性,为树鼩的饲养管理及大肠杆菌病的防治提供一定思路。【方法】 无菌采集树鼩肛拭子样品129份,采用麦康凯培养基、LB琼脂培养基、革兰氏染色和生化试验进行细菌分离鉴定,用PCR法对分离菌株进行HPI相关基因检测,经PCR鉴定后筛选HPI阳性菌株并对该菌株的主要结构基因irp2和fyuA进行相似性分析和系统发育树构建,采用纸片扩散法对分离菌株进行药敏试验。【结果】 129份树鼩肛拭子样品共分离得到123株大肠杆菌,分离率为95.35%（123/129）;革兰氏染色结果显示,分离菌株镜检为红色粗短杆菌;生化鉴定结果显示,分离菌株对乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨和甘露醇生化反应呈阳性,硫化氢和尿素酶生化反应呈阴性,均符合大肠杆菌特性;PCR产物电泳结果显示,HPI相关基因检出率为88.62%（109/123）,irp2基因携带率为34.15%（42/123）,fyuA基因携带率为47.97%（59/123）;主要结构基因序列分析结果显示,irp2和fyuA基因与GenBank中公开发表的irp2和fyuA基因序列相似性分别达到98.6%和98.9%以上;系统发育树结果显示,分离菌株与耶尔森菌属亲缘关系较近;耐药性分析结果显示,分离菌株对阿米卡星和氟苯尼考敏感,对阿莫西林和苯唑西林耐药,耐药率分别为87.80%和81.30%。【结论】 HPI相关基因在树鼩大肠杆菌中广泛分布,进一步证实HPI可发生水平转移,且主要结构基因irp2和fyuA的遗传具有较高保守性。     

大肠埃希菌ETT2毒力岛ECs3703基因和HPI毒力岛irp2基因双重LAMP检测方法的建立

根据GenBank中大肠埃希菌ETT2毒力岛保守基因ECs3703和HPI毒力岛的保守基因irp2分别设计一套LAMP引物,在同一体系中进行LAMP扩增,通过对体系Mg2+、dNTP、内引物及反应温度和反应时间等进行优化,建立了在60℃恒温下对大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛进行同步检测的LAMP方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的双重LAMP检测方法同时检测ETT2和HPI毒力岛大肠埃希菌检测限均可达到100fg,比常规PCR灵敏度高100倍。利用该方法对8株非大肠埃希菌进行LAMP扩增,结果均为阴性。用该方法对采集的20份临床样品进行检测,与双重PCR检测结果一致。结果显示,该双重LAMP方法可用于大肠埃希菌ETT2和HPI毒力岛的同步快速检测,可作为临床疫病诊断的有效手段。     

牛源大肠杆菌对秀丽隐杆线虫的致病性研究

为建立牛源大肠杆菌-秀丽隐杆线虫致病模型,本研究从广西南宁、桂林、柳州等地区收集的牛病料中分离出13株大肠杆菌,继而对这些大肠杆菌进行血清学鉴定及小鼠、秀丽隐杆线虫的致病性试验。采用玻片凝集法鉴定大肠杆菌的O血清型,并将13株大肠杆菌培养液以3.0×10⁹ CFU/mL、0.2 mL/10 g体重给小鼠腹腔注射,同时分别喂食N2野生型秀丽隐杆线虫。结果显示,大肠杆菌的O血清型为O127、O126和O44,其中O126为优势血清型（4/13）。致病性结果显示,有11株大肠杆菌能使小鼠致死（致死率为40%~100%）,2株大肠杆菌对小鼠没有致死性（致死率为0）。对小鼠有强致病性的大肠杆菌,对线虫的致死率也较高,死亡率在第3~6天最为显著,半数致死时间为3~4.5 d,最长存活时间为9 d;对小鼠不致死的两株大肠杆菌对线虫的致死率也较低,线虫死亡率下降趋势缓慢,半数致死时间为5~6 d,最长存活时间为10~11 d。肠道细菌计数结果显示,大肠杆菌在线虫体内的数量与时间呈线性关系,大肠杆菌不断破坏线虫的免疫系统,从而导致了线虫的死亡。本研究结果表明,大肠杆菌对线虫和小鼠的致病力试验结果一致,说明成功建立了牛源大肠杆菌-秀丽隐杆线虫致病模型,为牛病防治与临床用药提供了依据。     

鸭源大肠杆菌的分离鉴定及致病性分析

【目的】了解江苏、江西、安徽地区鸭源大肠杆菌的分布以及致病性情况。【方法】本研究对江苏、江西、安徽地区的病死鸭进行了鸭源大肠杆菌的分离鉴定,运用PCR结合玻片凝集法测定鸭源大肠杆菌分离株的血清型,并进行了18种毒力基因的PCR检测,随后进行雏鸭致病性试验,并对毒力较强和毒力较弱的菌株进行生长曲线以及半数致死量(LD₅₀)测定。【结果】本研究共分离鉴定获得鸭源大肠杆菌74株,鉴定为O1、O2、O18、O78血清型的分别有1、2、2和4株,其余均未定型;18种毒力基因鉴定结果表明,ibeB、yijp、OmpA和mat基因检出率分别为97.3%、97.3%、95.95%和90.54%。动物致病性试验结果表明,经10⁷ CFU/只攻毒后,74株分离株均引起雏鸭不同程度发病,但仅有2株对雏鸭致死率≥50%。生长曲线测定结果表明,2株强毒株与2株弱毒株的生长速度无显著差异(P>0.05),2株强毒株的LD₅₀分别为10^4.75和10^7.375 CFU。【结论】本研究分离的74株鸭源大...     

豪猪源肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及致病性研究

【目的】 查明引起福建省龙岩市某豪猪养殖场致豪猪腹泻死亡的病原菌及其特征,为该病的科学防控及合理用药提供参考依据。【方法】 分离腹泻死亡豪猪的病原,并结合形态特征、生理生化试验、16S rRNA基因扩增、种系发育分群鉴定分离菌株;通过毒力基因检测、动物致病性试验及药敏试验对分离菌株的致病性和耐药性进行研究。【结果】 从发病死亡豪猪肝脏组织中分离到1株大肠杆菌,命名为Fj/Porcupine2018,该分离菌株与22株不同来源的参考菌株16S rRNA序列之间的相似度为97.4%~99.8%,其中与禽源分离株（登录号：MN022583）和人源分离株（登录号：MW881377）的序列相似度高达99.8%;种系发育分群证实该分离菌株属于B1群。毒力基因检测结果显示,该分离菌株除检出肠侵袭型大肠杆菌毒力基因EinV外,还检出papC、iroC、Afa、luxs、stx2f及ompA 6种毒力相关基因。动物致病性试验显示,该分离菌株对小鼠具有较强的致病性,小鼠在攻毒后31 h内全部死亡,且肝脏、脾脏、肺脏及肠道等器官组织均有明显的病理损伤;在对常见抗菌药物的药敏试验中,该分离菌株对大环内酯类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、头孢类、氨基糖苷类、青霉素类7类11种药物表现出不同程度的耐药,耐药率为25%~100%,仅对头孢曲松和头孢西叮2种药物表现敏感。【结论】 本研究分离获得了1株腹泻死亡豪猪的病原菌大肠杆菌,通过一系列生物学特性研究证实该分离菌为1株具有较强致病力且呈现多重耐药性的B1群肠侵袭型大肠杆菌,为豪猪等野生动物大肠杆菌病的防控提供了重要的参考依据。     

携带耶尔森强毒力岛的大肠埃希菌耐药性及其对雏鸭的致病性试验

为了解105株动物源携带耶尔森强毒力岛的大肠埃希菌耐药状况和致病性,分别对各分离菌进行28种抗菌药物的敏感性测定,并选择不同毒力基因型的10株大肠埃希菌进行雏鸭的致病性试验.结果表明,分离菌对四环素、多西环素、氨苄西林、阿莫西林、复方磺胺甲(噁)唑、链霉素耐药性较高,耐药率均在80%以上;敏感率在80%以上的药物有头孢...     

河北省犊牛腹泻大肠杆菌致病性及耐药性分析

为确定河北省犊牛腹泻大肠杆菌的致病性与耐药性,本研究对2018年1月至2019年6月期间从河北省石家庄、保定、承德、唐山、廊坊的部分肉牛场腹泻犊牛样品中分离到的50株大肠杆菌进行了致病性试验、药物敏感性试验、毒力基因和耐药基因检测。结果显示:50株分离菌均对小鼠具有致病性,致病菌占比100%(50/50)。毒力基因fyuA、irp2、eaeA、ler检出率分别为68.0%、66.0%、34.0%、34.0%。50株分离菌均对15种抗生素中的2种及以上表现为耐药,对10种及以上抗生素耐药的菌株占比达34%(17/50);分离菌对土霉素、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、替米考星4种药物表现为高度耐药,耐药率分别为90%、90%、94%、100%。除四环素类tetD基因检出率为0外,其它耐药基因均有检出,其中四环素类tetC、氨基糖苷类aadA1、喹诺酮类gyrA、gyrB基因检测率高达100%。试验的50株大肠杆菌均具有较强的毒力和多重耐药性。本研究为河北省大肠杆菌所致犊牛腹泻病的防治提供了实验依据。     

犊牛腹泻源大肠杆菌耐药情况及HPI相关基因的检测

本研究旨在明确犊牛腹泻源性大肠杆菌的耐药情况、强毒力岛（HPI）标志基因及相关基因的携带情况,以及大肠杆菌分离株与HPI携带的关系。采集犊牛病理性腹泻样本158份,采用麦康凯培养基和伊红美蓝培养基进行筛选,镜检符合大肠杆菌形态的进行VITEK 2 Compact生化鉴定和PCR鉴定,采用K-B纸片法对大肠杆菌分离株进行药敏试验,应用PCR方法进行分离株HPI相关基因携带情况的检测。结果显示,共分离得到75株大肠杆菌,分离株对阿莫西林、哌拉西林、氨苄西林、头孢唑啉、氟苯尼考、恩诺沙星、四环素的耐药率均>90%,对头孢氨苄、头孢拉定、头孢曲松、环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星的耐药率均≥ 60.00%,对阿米卡星较敏感,耐药率为9.33%;75株大肠杆菌全部耐3种以上药物,多重耐药（≥ 10）的菌株占85.33%,耐药谱集中在耐14~17种药物,5株对19种药物全部耐药。HPI标志基因irp2的阳性率为100%,其他相关基因fyuA、irp3、irp5、irp8和ytbA的检出率在66.00%以上。综上所述,宁夏地区犊牛腹泻源性大肠杆菌耐药普遍,多重耐药现象严重。     

小熊猫源大肠杆菌的药敏特性及致病性

为探明死亡圈养小熊猫(Ailurus fulgens)体内分离大肠杆菌(Escherichia coli,MT820501)的耐药情况及致病性,对分离菌株进行药敏特性分析,同时以小鼠感染实验检测其致病性。结果显示:该分离菌株对哌拉西林、头孢西丁、头孢曲松、头孢吡肟、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦、氨苄青霉素-舒巴坦、卡那霉素、丁胺卡那、新霉素、米诺环素、左氧氟沙星、呋喃唑酮、多黏菌素B敏感,对大部分β-内酰胺类药物及少部分氨基糖苷类药物耐药;小鼠感染实验结果显示,分离菌株半数致死量为8.42×10⁷cfu/m L,死亡小鼠体内分离出与小熊猫体内一致的菌株,病理表现为各实质脏器出现不同程度水肿、充血及炎性细胞浸润,与死亡小熊猫病理损伤特点高度相似,但不完全相同,这可能与感染方式、种属差异、耐受性等相关。     

重组犬IL-2在原核细胞中的高效表达

应用RT-PCR技术克隆犬IL-2基因，并插入到原核表达载体PJLA605中，构建pRL-CaIL-2表达质粒；采用M9培养基摇瓶发酵，确定诱导时机和诱导表达时间。结果表明：工程菌pRL-CaIL-2在30C培养至对数生长后期（OD600为1．5）42C诱导4h时。菌体收得量湿重达17．8g／L，目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的29．7％。外源基因在该基因工程菌中得到了高效表达。