白藜芦醇对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

本实验探究体外成熟(IVM)培养基中添加不同浓度白藜芦醇(0、0.5、2.0、5.0μmol/L RES)对绵羊卵母细胞核质成熟的影响。IVM 24 h后观察卵丘细胞扩展率和卵母细胞第一极体形成情况,并检测卵母细胞细胞质内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)含量。结果表明:与对照组相比,0.5μmol/L RES组的卵丘细胞扩展率无显著差异,卵母细胞第一极体的形成显著提高,卵母细胞胞质中ROS显著降低,GSH含量显著提高;添加量增至5.0μmol/L卵丘扩展率、第一极体形成率、胞质内GSH含量显著下降。综上所述,在绵羊卵母细胞IVM液中添加0.5μmol/L RES通过降低胞质内ROS及提高GSH含量增强卵母细胞抗氧化能力,提高卵母细胞核成熟率及胞质质量,而促进卵母细胞体外成熟。     

白藜芦醇对绵羊卵母细胞体外受精的影响

本试验旨在研究不同浓度（0、0.5、2.0、5.0 μmol/L）白藜芦醇（resveratrol,RES）对绵羊卵母细胞体外受精（in vitro fertilization,IVF）、卵母细胞抗氧化能力及卵丘细胞分泌类固醇激素的影响。绵羊卵母细胞在含不同浓度RES的体外成熟（in vitro maturation,IVM）液中培养24 h以后进行体外受精,并收集IVM液,测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）的活性及脂质过氧化产物丙二醛（monochrome display adapter,MDA）的含量;用酶联免疫法测定雌二醇（estradiol,E₂）和孕酮（progesterone,P₄）的浓度。研究结果表明,与对照组相比,在IVM液中添加0.5 μmol/L RES显著提高卵裂率（P<0.05）,但对受精率和囊胚率没有显著影响（P>0.05）;5.0 μmol/L RES显著降低受精率、卵裂率和囊胚率（P<0.05）,对胚胎发育有抑制作用;在IVM和体外培养（in vitro culture,IVC）液中分别添加0.5 μmol/L RES均显著提高受精率、卵裂率和囊胚率（P<0.05）。与对照组相比,在IVM液中添加RES对卵丘细胞分泌E₂有一定的抑制作用,5.0 μmol/L RES显著降低E₂浓度（P<0.05）;0.5 μmol/L RES显著提高卵丘细胞P₄分泌量（P<0.05）。0.5和2.0 μmol/L RES增加SOD和GSH-Px等酶的活性,但与对照组相比无显著差异（P>0.05）,却显著降低MDA含量（P<0.05）;而5.0 μmol/L RES显著降低抗氧化酶活性并增加MDA含量（P<0.05）。综上所述,在IVM和IVC液中同时添加0.5 μmol/L RES,通过增强卵母细胞抗氧化能力和P₄的浓度,并降低MDA含量,从而提高胚胎卵裂率和囊胚率。     

绵羊胚胎成纤维细胞的体外培养

用组织块法对绵羊胚胎成纤维细胞进行原代和传代培养,探讨绵羊胚胎成纤维细胞适宜的培养模式.成功获得较均一稳定的细胞群体,并成功地对细胞进行了冷冻保存和复苏.对于进行大规模的动物细胞培养具有重要的指导意义.     

hCG对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

为了探讨hCG对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。从屠宰场获取绵羊卵巢后,采用机械切割法获取卵母细胞,在hCG为0u／L（对照组）、5u／L（低浓度）、10u／L（中浓度）、15u／L（高浓度）的培养液中体外成熟培养24h,计算成熟率。结果表明：hCG对绵羊卵母细胞体外成熟培养无显著影响（P〉0．05）。     

绵羊卵母细胞体外成熟的研究

研究了FSH／LH浓度、年龄和采卵季节对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：①FSH／LH能促进绵羊卵母细胞体外成熟，适宜的添加浓度很重妻。本实验条件下，添加量以10μg／ml为宜。②成年绵羊卵母细胞成熟率高于性成熟前绵羊，但无显著差异。③发情季节绵羊卵母细胞较乏情季节易成熟。     

季节对绵羊卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

试验采用梯度LH与E2的作用浓度比较卵母细胞的体外成熟率,并采用添加7.0μg/mLLH、1.3μg/mLE2研究季节性对绵羊卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响。结果表明:①LH与E2的作用浓度对非繁殖季节(5月)卵母细胞成熟率影响差异不显著(P>0.05),但以添加LH7.0μg/mL、E21.3μg/mL组卵母细胞成熟率较好。②LH与E2的作用浓度对繁殖季节(12月)卵母细胞成熟率影响差异不显著(P>0.05),以LH10.0μg/mL与E21.3μg/mL时卵母细胞成熟率较好。③湖羊和其他季节性发情绵羊卵母细胞的成熟率在繁殖季节(72.08%vs69.82%)与非繁殖季节(67.89%vs65.79%)差异不显著(P>0.05),但以繁殖季节的成熟率较高。④湖羊的卵母细胞在非繁殖季节与繁殖季节胚胎卵裂率(72.28%vs75.43%)、桑葚胚率(36.14%vs34.97%)差异不显著(P>0.05),繁殖季节囊胚率比非繁殖季节囊胚率偏高(16.18%vs14.40%)。     

绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养的研究

在体外受精过程中,绵羊卵巢卵母细胞体外成熟情况在很大程度上决定着卵母细胞的体外受精率和胚胎发育率.影响卵母细胞成熟的因素很多,主要包括卵泡大小、卵巢的发育阶段、培养基、激素生长因子等.试验从屠宰场采集屠宰后的绵羊卵巢,抽取卵巢表面卵泡中的卵母细胞,选择一级和二级卵母细胞进行体外成熟培养.试验证明,绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养时间以24h为佳,FCS浓度以20%最适宜.试验还发现无菌条件、温度、湿度以及在体外对卵母细胞的操作时间对试验的结果都有很大的影响.通过试验初步探明了适宜绵羊卵母细胞体外成熟的一些基本条件,为全面掌握绵羊卵母细胞体外成熟培养以至整个体外受精技术的完善和规范提供了有益的资料.     

FSH对绵羊卵母细胞体外核成熟的影响

为了探讨FSH对绵羊卵母细胞核成熟的影响,本试验将绵羊卵母细胞体外成熟24 h,并在成熟过程中的4个不同时间段内添加FSH,统计各个时间段卵母细胞的生发泡破裂(germinal vesicle break down, GVBD)及第一极体排出情况。结果显示：①在体外成熟培养的前4 h或前8 h添加FSH,经体外成熟的卵母细胞其生发泡破裂率与不添加FSH组无显著差异;②在体外成熟的4~24 h或8~24 h添加FSH,其第一极体排出率与不添加FSH组有极显著差异。说明,在本试验条件下,FSH对绵羊卵母细胞体外成熟具有显著的促进作用,是在减数分裂的恢复后到减数分裂完成之间的某一阶段起的促进作用。     

外源褪黑素对猪卵母细胞体外成熟及多精受精的影响

本研究旨在探讨褪黑素对猪卵母细胞体外成熟及多精受精的影响。在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加1 nmol/L褪黑素或1 nmol/L褪黑素+1 nmol/L Luzindole作为试验组,不添加褪黑素及Luzindole作为对照组,检测卵母细胞核成熟率、多精受精率,并观察体外受精胚胎的发育能力及与多精受精相关的细胞器分布情况。结果表明：各组间卵母细胞核成熟率及体外受精胚胎的卵裂率无显著差异;褪黑素组的猪卵母细胞多精受精发生率较其他2组降低（P<0.05）,囊胚形成率提高（P<0.05）,同时猪卵母细胞皮质颗粒及高尔基体的正常分布情况得到显著改善。结果证明,在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加1 nmol/L褪黑素可显著改善卵母细胞成熟质量,抑制多精受精的发生。     

用转染或非转染的胎儿成纤维细胞克隆侏儒山羊

本文对山羊胎儿成纤维细胞经体外转染 ,核移植后核的发育潜能性进行了研究。1　材料和方法1.1　分离供体细胞利用外科手术从侏儒山羊 BEL E品系 (配种早 ,泌乳早 ) 2 7～ 30 d胎儿分离出成纤维细胞。将去头和内脏的胎儿机械分离 ,于 DMEM+2 0 % FBS+2 0 mg/m L庆大霉素、38℃和 5 % CO2 条件下培养。培养中成纤维细胞生长占优势 ;当细胞生长丰度达 70 %时转移到 0 .0 5 %胰蛋白酶 - EDTA中处理 ,记数。一半冷冻于10 % DMSO+90 % FBS中 ,另一半放入有孔培养板中作遗传学分析。解冻后染色体正常的细胞用于核移植或转染 DNA以繁殖…     

Effects of Resveratrol on in vitro Fertilization of Sheep Oocytes

The purpose of this study was to investigate the effects of resveratrol (RES) at different concentrations (0,0.5,2.0,5.0 μmol/L) on in vitro fertilization (IVF) and antioxidant capacity of ovine oocytes and the secretion of steroid hormones by cumulus cells.Sheep oocytes were fertilized in vitro after maturated in different concentrations of RES for 24 h,and the in vitro maturation (IVM) medium was collected for detecting the enzyme activity of superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase (GSH-Px) and the content of monochrome display adapter (MDA).The ELISA method was used to detect the concentration of estradiol (E₂) and progesterone (P₄).The results showed that when compared to the control group,adding 0.5 μmol/L RES to the IVM medium significantly increased the cleavage rate (P<0.05),but had no significant effect on the fertilization rate and blastocyst rate (P>0.05);5.0 μmol/L RES significantly reduced the fertilization rate,cleavage rate and blastocyst rate (P<0.05),which had an inhibitory effect on embryonic development.Adding 0.5 μmol/L RES to IVM and IVC (in vitro culture,IVC) medium significantly increased the fertilization rate,cleavage rate and blastocyst rate (P<0.05).Compared to the control group,the addition of RES to IVM solution had a certain inhibitory effect on the secretion of E₂ by cumulus cells,5.0 μmol/L RES significantly reduced E₂ concentration (P<0.05);0.5 μmol/L RES significantly increased the P₄ secretion of cumulus cells (P<0.05).0.5 and 2.0 μmol/L RES increased the activity of SOD,GSH-Px and other enzymes,but there was no significant difference when compared with the control group (P>0.05),but significantly reduced MDA content (P<0.05),while 5.0 μmol/L RES significantly reduced the activity of antioxidant enzymes and increased the content of MDA (P>0.05).In conclusion,0.5 μmol/L RES simultaneously added to IVM and IVC medium could enhance the antioxidant capacity of oocytes and concentration of P₄,and reduced the content of MDA,thus improved the cleavage rate and blastocyst rate.     

绵羊卵丘细胞对裸卵体外成熟及孤雌发育影响的研究

本研究探讨绵羊卵丘细胞对裸卵体外成熟和后期发育的影响。实验分为4组,对照组为卵丘-卵母细胞复合体(COCs);裸卵(DO)组;COCs与DO共培养组(CODO);卵丘细胞(CC)与DO共培养组(CCDO)。体外成熟培养18 h后,检测各组卵子成熟质量并进行孤雌发育研究。结果表明:CODO和CCDO组中裸卵活率显著高于DO组(P<0.05),但显著低于COCs组(P<0.05),且COCs组中卵子活率极显著高于DO组(P<0.01);在极体排出率方面,CODO、CCDO和DO3组差异不显著(P>0.05),但是它们都显著低于COCs组(P<0.05)。COCs、CODO、CCDO和DO 4组卵裂率差异均不显著(P>0.05)。然而,DO组的囊胚率显著低于CODO和CCDO组(P<0.05),极显著低于COCs组(P<0.01),但CODO和CCDO 2组中裸卵的囊胚率差异不显著(P>0.05)。总之,无论散在的卵丘细胞还是COCs均能提高裸卵体外成熟及后期发育潜力。     

湖羊FecB基因在新疆细毛羊胎儿成纤维细胞中的表达

为培育携带FecB多胎基因的高繁殖率新疆细毛羊,本研究提取了湖羊卵巢的总RNA,在此基础上反转录为cDNA,通过PCR扩增得到了湖羊的FecB基因,再与pMD19-T载体连接,构建了pMD19-T-FecB重组质粒。通过双酶切与真核表达载体pEGFP-N1连接,得到了pEGFP-N1-FecB真核表达载体。经测序与酶切证明,成功构建了pEGFP-N1-FecB真核表达载体,并转染新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,通过药物筛选获得了表达湖羊FecB基因的阳性新疆细毛羊胎儿成纤维细胞,为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础。     

不同采卵方式对绵羊卵母细胞质量、体外成熟及体外受精的影响

随着胚胎工程及胚胎相关技术的发展,绵羊卵母细胞和绵羊胚胎的需求量日益增加.获得尽可能多的结合型卵母细胞是体外受精的关键环节.本试验通过剖切法和抽吸法两种不同采卵方式获取卵母细胞并进行体外成熟培养.剖切法获得的卵母细胞数量高于抽吸法,所用时间相差不大.A、B级卵母细胞的比例在剖切法中显著高于抽吸法(P＜0.05),抽吸法所采集的C级卵母细胞显著高于剖切法(P＜0.05);剖切法中卵丘扩散率和第一极体排出率要显著高于抽吸法(P＜0.05),受精后不同时期胚胎的发育率差异不显著(P＞0.05).表明剖切法是采集绵羊卵母细胞的理想方法.     

牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因

为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染.克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体.用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24 h后观察荧光表达,48 h后加入600μg·mL-1 G418,筛选1周,300 p.g·mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养.对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析.结果,转染24 h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEGFP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1500 bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体.说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性.可以作为核移植进行转基因克隆牛研究.     

发情牛血清对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

在动物卵母细胞体外成熟及胚胎体外培养体系中添加一定浓度的发情牛血清可能提高卵母细胞的成熟率及胚胎的发育率。本研究以屠宰场卵巢来源的绵羊卵母细胞为试验材料,探讨了发情牛血清对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。结果表明,成熟液中添加10%第1天的发情牛血清能显著提高绵羊卵母细胞的体外成熟率及孤雌胚卵裂率(P＜0.05);孤雌胚体外培养72 h后,向培养液中添加10% 第7天的发情牛血清能显著提高绵羊孤雌胚的桑囊胚率(P＜0.05)。结果表明,发情牛血清能够促进绵羊卵母细胞的体外成熟率及孤雌胚发育率。     

羊卵母细胞冷冻保存研究进展

近年来,绵羊、山羊胚胎工程技术的快速发展致使对卵母细胞的需求量越来越大。此外,作为家畜种质资源保护体系的组成部分,卵母细胞也是保存优秀雌性家畜遗传资源的重要方式之一。然而,作为胚胎生物技术的重要环节,由于其自身特殊的结构功能特点,卵母细胞对低温和冷冻极其敏感,其冷冻保存研究水平远低于胚胎。因此,如何提高冷冻保存卵母细胞质量是低温生物学和胚胎生物技术研究领域的热点和难点。针对目前绵羊、山羊卵母细胞冷冻保存的最新研究进展和存在问题进行综述,同时针对如何进一步提高绵羊、山羊卵母细胞冷冻保存质量提出建议,以期为之后的研究工作提供理论指导。     

蒙古绵羊胎儿皮肤成纤维细胞分离培养与特性分析

本研究以蒙古绵羊胎儿为材料,进行了胎儿性别鉴定,结果显示为雄性。取其皮肤组织进行离体培养,对所获得的细胞进行纯化,筛选出成纤维细胞。通过形态观察发现,在10代以内,细胞形态良好,随着代数增加梭型细胞有拉长趋势,在第20代时梭形明显拉长,单位面积细胞数目大量减少;同时做了F5、F10代细胞的生长曲线,发现随着代数的增长,细胞生长力略有下降,但趋势不明显;对F5、F10代细胞做了核型分析,二倍体比率分别为85.71%和76.67%,这满足了作为核移植供体细胞的要求;细胞冻存后复苏贴壁情况良好。     

乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

【目的】研究乙草胺对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,为研究体内乙草胺对卵母细胞质量的影响提供参考。【方法】将收集的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes, COCs)置于含有不同浓度(0(对照组)、10、50、100、130、200μmol/L)乙草胺的体外成熟培养液中培养14 h,统计卵母细胞第一极体排出率,进行体外受精后,统计体外受精胚胎的囊胚率,筛选出适宜于卵母细胞体外培养的乙草胺浓度。将COCs在对照组和筛选出的适宜浓度的乙草胺组成熟培养液中培养14 h后,利用DCFH-DA检测卵母细胞活性氧(ROS)水平;利用CellTracker^TM蓝色染料检测卵母细胞谷胱甘肽(GSH)水平;利用JC-1染色法检测卵母细胞线粒体膜电位水平(mitochondrial membrane potential, MMP);利用实时荧光定量PCR检测卵母细胞内凋亡相关基因的表达水平,利用Hoechst 33342染色检测体外受精胚胎的囊胚细胞总数,用Fluorescein-dUTP染色法检测囊胚细胞凋亡率。【结果】与对照组相比,100、130、20...