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我国科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型
　　中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员、吉林大学教授赖良学博士的研究团队利用最新的CRISPR/Cas9基因敲除技术成功地培育出两种基因敲除克隆小型猪,即酪氨酸酶基因敲除猪和PARK2和PINK1双基因敲除猪,建立了人类白化病和帕金森综合征两种猪模型。     

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我国科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型 10月14日消息．中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员、吉林大学教授赖良学博士的研究团队利用最新的CRISPR／Cas9基因敲除技术成功地培育出两种基因敲除克隆小型猪,即酪氨酸酶基因敲除猪和PARK2和PINKl双基因敲除猪,建立了人类白化病和帕金森综合征两种猪模型。     

我国科学家新建立两种基因敲除克隆猪模型

<正>10月14日消息,中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员、吉林大学教授赖良学博士的研究团队利用最新的CRISPR/Cas9基因敲除技术成功地培育出两种基因敲除克隆小型猪,即酪氨酸酶基因敲除猪和PARK2和PINK1双基因敲除猪,建立了人类白化病和帕金森综合征两种猪模型。此次赖良学研究团队将新兴的CRISPR/Cas9技术与体     

成年版纳微型猪近交系克隆猪的制备

本研究以版纳微型猪近交系成年母猪为材料,采用冷胰酶消化法获得成年猪成纤维细胞后,进行细胞的生物学特征检测,研究其作为供体细胞对体细胞核移植效果的影响。结果表明,版纳微型猪近交系成年猪的成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态,细胞冻存前和复苏后存活率分别为97.2%和92.6%(P>0.05),生长曲线呈"S"形,细胞群体倍增时间为36h,体外培养14代后仍能保持正常核型。以其作为核移植供体细胞,核移植重构胚卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数分别为61.9%、13.0%和37枚,移植了重构胚的3头代孕母猪均妊娠,并且有1头母猪产下1头正常的克隆猪。综上所述,利用版纳微型猪近交系成年猪能建立稳定的成纤维细胞系,该细胞系作为核移植供体细胞可获得版纳微型猪近交系克隆猪。     

猪MSTN基因敲除载体的构建及细胞筛选

构建猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因的打靶载体并获得敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞.以Puro为正筛选基因,白喉毒素-A(DT-A)为负筛选基因.将同源长臂和同源短臂分别插入Puro基因的两侧.同源长短臂分别为4 294 bp和1 015 bp,定点敲除MSTN基因的部分内含子2和部分外显子3.采用FugeneHD 转染法将打靶载体转入37 d的猪胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用嘌呤霉素筛选.结果显示,成功构建了对猪MSTN基因部分区域进行敲除的打靶载体,共得到48个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,获得2个正确同源重组的细胞克隆.     

梅山猪耳成纤维细胞体外培养及其克隆

为获得适合于克隆梅山猪的供体细胞,本试验对梅山猪耳皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化、生长特征和核型分析等进行了研究。通过组织块培养法获得梅山猪皮肤成纤维细胞,用胰酶轻度消化后传代3⁴次可得到较纯的皮肤成纤维细胞,并以此作为供体细胞,获得1头健康梅山克隆猪。     

网络快递

1　直接注射胎儿成纤维细胞进行猪体细胞克隆猪的体细胞克隆在优化猪肉生产和人的器官移植方面具有很重要的意义。为了克隆猪 ,我们将猪的胎儿成纤维细胞直接注射到去核的卵母细胞内 ,然后电激活使之发育。把 10枚克隆胚胎移植到 4头受体母猪 ,出生了一头克隆仔猪。通过皮肤颜色和ＤＮＡ卫星分析证明这头仔猪是体细胞克隆猪。ＡｋｉｒａＯｎｉｓｈｉＭａｓｋｉＬｗａｍｏｔｏｅｔａｌ.(2 0 0 0 )Ｓｃｉｅｎｃｅ .2 89:1188- 11902　家畜精液冷冻自第一次成功冷冻精子 5 0年以来 ,这项技术已经成为牛育种产业的一个组成部分 ,但在其它家畜繁…     

体细胞克隆技术在乌金猪遗传资源保护上的应用

旨在通过猪体细胞克隆技术,生产乌金猪火毛系,并分析生长发育能力及繁殖性能,为该技术在地方优良猪种保种上的应用提供理论依据。本研究采集了符合乌金猪种质特征的3头公猪和12头母猪的耳组织样品。公猪年龄分别为3、6、11月龄,母猪年龄差距较大,最小的2月龄,最大的10岁。其中3头母猪和1头3月龄公猪已被去势,10岁母猪已无繁殖能力。结果,成功建立了15头乌金猪的耳组织成纤维细胞系,分别选择1头3月龄乌金猪（♂）和10岁乌金猪（♀）的成纤维细胞进行体细胞核移植,经胚胎移植入16头代孕母猪,共获得25头克隆猪,克隆猪生长发育正常,性成熟后进行自然交配共获得39头F1代活仔。本研究通过体细胞克隆技术成功克隆了乌金猪,具备正常的生长发育性能和繁殖性能,为地方猪种的保护研究提供了新的途径。     

广西巴马小型猪供核细胞的传代培养和冷冻保存及肌肉成纤维细胞HDAC1基因的mRNA的表达

本试验旨在建立猪颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和新生巴马小型猪不同组织来源成纤维细胞的分离及传代培养技术体系和冷冻保存方法,并比较猪卵丘/颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDAC1基因的mRNA表达的差异,从分子水平上鉴定新生巴马小型猪肌肉成纤维作为供体细胞的可行性。运用组织块贴壁培养方法分离不同来源的组织细胞进行培养,并比较了常规冷冻保存和微量冷冻保存对细胞复苏率的影响,同时,运用实时定量PCR的方法检测猪卵丘/颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDAC1基因mRNA表达的动态变化。研究结果表明：（1）猪颗粒细胞单层细胞的生长需要5～6d;用组织块法获得猪胎儿成纤维细胞单层的生长时间为10～11d;用组织块法可以成功地对新生巴马小型猪的肌肉、肺、肾脏、心、睾丸组织的成纤维细胞进行分离和传代培养,肾和睾丸组织的成纤维细胞贴壁生长后,长满形成单层细胞需要12～13d,而肺、肌肉和心脏组织的则需要15～16d。（2）细胞的微量冷冻保存效果优于常规冷冻保存（P〈0.05）。（3）猪卵丘/颗粒细胞与新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDACl mRNA的相对表达量为1.000比0.985,两者差异不显著（P〉0.05）。新生广西巴马小型猪不同组织来源的成纤维细胞的分离及传代培养和微量冷冻法,丰富了这种猪体细胞的分离培养种类,为其体细胞核移植研究提供了丰富的供体细胞,并从表观遗传的角度分析,鉴定了新生巴马小型猪胎儿成纤维细胞与猪卵丘/颗粒细胞一样适合作供体,为核移植前的供体细胞鉴定提供了新的方法。     

PLIN2调控宁乡猪原代肾成纤维细胞ω-3 PUFA组成的研究

为研究PLIN2基因对中国本土猪宁乡猪长链omega-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFA）的调控作用，利用CRISPR/Cas9技术敲除宁乡猪原代肾成纤维细胞PLIN2基因，获得PLIN2纯合敲除细胞系，检测其脂肪酸含量及组成变化。结果显示：与野生型细胞相比，PLIN2-/-细胞的多不饱和脂肪酸总含量增加55.92%，ω-3 PUFA含量增加112.02%，多不饱和脂肪酸含量在总脂肪酸中的占比由27.78%增加至34.40%。因此，PLIN2基因对宁乡猪原代肾成纤维细胞多不饱和脂肪酸和ω-3PUFA的形成具有正向调控作用。本研究为揭示PLIN2调控脂肪酸的分子机理提供了重要参考，并为猪肉品质改良的生物育种提供了候选靶点。     

转Lp-PLA2猪成纤维细胞系的建立及其功能鉴定

根据NCBI上公布的猪Lp-PLA2mRNA序列设计引物,以小型猪肺脏cDNA为模板进行PCR,将扩增产物连接进入具有EF1α启动子的pIRES2-EGFP真核表达载体中,并对其功能进行鉴定。然后,将猪Lp-PLA2表达载体转染入小型猪胎儿成纤维细胞,经过G418抗性筛选,鉴定,成功得到5株转Lp-PLA2基因的猪成纤维细胞系。这为下一步建立Lp-PLA2转基因猪及其功能研究奠定基础。     

转Lp-PLA_2猪成纤维细胞系的建立及其功能鉴定

根据NCBI上公布的猪Lp-PLA2mRNA序列设计引物,以小型猪肺脏cDNA为模板进行PCR,将扩增产物连接进入具有EF1α启动子的pIRES2-EGFP真核表达载体中,并对其功能进行鉴定。然后,将猪Lp-PLA2表达载体转染入小型猪胎儿成纤维细胞,经过G418抗性筛选,鉴定,成功得到5株转Lp-PLA2基因的猪成纤维细胞系。这为下一步建立Lp-PLA2转基因猪及其功能研究奠定基础。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示，猪的卵丘细胞生长形成单层需要5～6d；运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系，这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

猪Mx1基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达

为获得转Mx1基因的阳性陆川猪成纤维细胞,本研究以干扰素诱导猪成纤维细胞Mx1基因表达,提取细胞总RNA,RT-PCR获得编码猪Mx1蛋白的cDNA;以pMSCV-IRES-GFP为骨架构建猪Mx1基因表达载体pMSCV-IRES-GFP-Mx1,并利用脂质体2000介导重组质粒转染陆川猪胎儿成纤维细胞,通过荧光观察和PCR检测分析结果表明Mx1蛋白基因整合进入陆川猪胎儿成纤维细胞。     

世界首例转基因克隆猪在英国诞生

英国的 PPLTherapeutics公司于 2 0 0 1年 4月 1 1日宣布 ,世界首例转基因克隆猪诞生 ,5头健康的克隆仔猪均含有外源标记基因。这是该公司 2 0 0 0年宣布世界首例克隆猪诞生之后又一重大成果。这次的克隆猪所不同的是 ,它们是由经过遗传修饰的体细胞核产生的。这一工作的成功进一步证明了生产基因敲除 ( knock-out)猪的可行性。这种基因敲除猪含有特异性的基因 ,可使人对猪器官产生排斥作用的免疫系统失活。 PPL公司此前曾报道过在猪细胞成功敲除靶基因 ,所用技术为该公司的专利技术 ,也就是他们生产转基因克隆绵羊丘比特 ( Cupid)和戴…     

富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪制备的关键技术研究

作者综述了制备富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪的研究意义和国内外的研究现状，并介绍了自己的研究进展。用化学合成的方法获得了C briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1，并构建了哺乳动物细胞表达载体。通过显微注射的方法制备了转基因小鼠，sFat-1基因能够在转基因小鼠中产生更多更长链的而且更有价值的DHA以及DPA。在确认sFat-1基因功能的基础上，将载体转染到猪胎儿成纤维细胞，利用阳性的细胞克隆通过核移植方式制备富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪。     

CRISPR/Cas9介导的猪IPEC-J2细胞CD13基因敲除细胞系的建立

旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13, CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA, gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染IPEC-J2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。     

世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”诞生

2008年9月9日17:40,世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”在位于中国长春的吉林大学农学部诞生。这标志着人类首次培育的“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”获得了成功。9月9日17:40至19:10,在吉林大学原种猪场,3头“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”先后顺利诞生,体质量分别为1 050、1 100和550 g。猪瘟是一种严重威胁养猪业的传染病。为了培育出能够抗猪瘟病毒的猪,以吉林大学农学部畜牧兽医学院赖良学教授为首席专家和军事医学科学院军事兽医研究所的专家共同组成的课题组,在国家自然科学基金资助的基础上,经过近2年时间的协作攻关,将能抑制猪瘟病毒的基因转染到“中国实验小型猪”胎儿成纤维细胞内,并以此体细胞进行核移植制备猪克隆胚胎,将此胚胎移植到杜洛克代孕母猪体内,怀孕114 d后顺利产出3头健康的克隆仔猪。经对仔猪体细胞进行基因检测,证实该克隆猪的细胞带有所转入的抗猪瘟病毒基因。进一步的抗病毒检测实验正在进行中。世界首例“带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪”诞生@王浩然     

新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞体外培养体系的建立

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力,免疫荧光进行鉴定;并通过脂质体介导对分离到的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离到新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传至60代以上。结果表明,本试验成功建立了新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞的体外培养体系,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞。     

猪TRIM56敲除细胞系的构建及在增殖PRRSV疫苗毒株中的应用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建1株猪TRIM56基因敲除的PAM-KNU细胞系，并探究其在增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)疫苗毒株中的应用。根据猪TRIM56基因组外显子区域设计合成2对特定的向导RNA引物，将引物磷酸化、退火并连接至Px459M和EZ-Guide-XH载体构建敲除质粒Px459M-sTRIM56-KO;将敲除质粒转染PAM-KNU细胞，经嘌呤霉素筛选、有限稀释法筛选获得单克隆细胞并扩大培养；通过RT-PCR、测序及Western blot筛选鉴定，最终获得了敲除细胞系sTRIM56-KO-PAM-KNU;将PRRSV R98疫苗株感染野生型细胞及敲除细胞系，利用real-time RT-PCR、半数组织培养感染量(TCID₅₀)以及Western blot检测PRRSV增殖情况。结果显示，TRIM56敲除细胞系构建成功，该敲除细胞系中sTRIM56基因编码区第929～2 120位1 192个碱基缺失，未检测到sTRIM56...