地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

产淀粉酶高温菌在淀粉酶的生产中具有重要意义。从温泉中分离到1株可在60℃快速生长的淀粉酶产生菌A12，经16SrDNA序列比较和丙酸盐利用等实验将其鉴定为地衣芽孢杆菌。构建了地衣芽孢杆菌A12基因库，并从中克隆到一个α-淀粉酶基因amyA1，对其进行了测序分析，并在大肠杆菌中实现了表达。本研究为构建一个耐高温淀粉酶生产用工程菌奠定了基础。     

马齿苋内生细菌的分离鉴定

为丰富我国野生植物内生细菌研究,对野生马齿苋内生细菌进行了分离鉴定。首先对新鲜的马齿苋全株进行表面消毒,充分研磨后,涂布于NA培养基上在28℃下培养1~2d。菌落产生后采用革兰氏染色结合显微观察初步鉴定,再利用16SrDNA序列分析方法,并利用NCBI中BLAST数据库对测序结果进行比对。结果表明,试验共分离得到6种菌,分别属于:肠杆菌属(E.sakazakil),短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),无色杆菌(Achromobacter spp.),类芽孢杆菌属(Paenibacillus),赖氏细菌属(Leifsonia)和Rhodanobacter sp(非模式菌株)。     

1株鸡肠源益生芽孢杆菌的分离·鉴定及其耐受特性研究

从人工饲养的健康仔鸡的盲肠和大肠中分离出1株对大肠杆菌有较强拮抗作用的芽孢杆菌菌株Y-1,对该菌株进行了菌落形态、培养特征观察和生理生化特性鉴定及16SrDNA序列的分析。以16SrDNA序列为基础构建了包括11株相关种属细菌在内的系统发育树,其中与11个芽孢杆菌属的菌株的16SrDNA序列的同源性为94．63％～99．35％,Y-1被鉴定为侧孢短芽孢杆菌。模拟体内高胆盐环境（胆盐含量0．3％）,监测菌株的耐受能力,然后测定在人工胃液、肠液环境中作用不同时间后的存活菌数。试验结果表明,Y-1在胆酸盐、人工胃液、人工肠液中表现出了很强的耐受能力。     

具有稻瘟病菌拮抗活性的枯草芽孢杆菌的分离与鉴定

采用梯度稀释分离法,从黄河稻区水稻根际土壤中分离出耐高温芽孢菌722株。通过真菌生长抑制试验,获得具有稻瘟病菌拮抗活性的菌株27株。通过形态学观察和生理生化指标鉴定,获得具有稻瘟病菌拮抗活性的枯草芽孢杆菌疑似菌株7株。挑取其中抑菌活性最强的1株进行16SrDNA鉴定,将其16SrDNA基因序列与GenBank中基因序列进行同源性比较,发现与枯草芽孢杆菌16SrDNA有99%同源性,判定此菌为枯草芽孢杆菌,命名为BS501a。     

香猪肺源性枯草芽孢杆菌的分离鉴定及体外抑菌作用

为获得猪呼吸系统的益生菌,以对疾病具有较强抗性的从江香猪为对象,从肺组织中分离到1株细菌Bp-1并对其进行形态学观察和生理生化特性鉴定,经克隆测序分析16SrDNA核苷酸序列和二级结构的相似性,利用琼脂扩散法和混菌拮抗培养法研究Bp-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌3种致病菌的抑制作用。结果表明:菌株Bp-1与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)位于同一分枝,相似性达100%;与已知枯草芽孢杆菌菌株168的16SrRNA可变区二级结构相比无明显差异,因此将Bp-1鉴定为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌Bp-1的液体培养物对3种致病菌均有抑制作用;对大肠杆菌的拮抗作用较强,对金黄色葡萄球菌的拮抗作用较弱。枯草芽孢杆菌Bp-1可作为猪呼吸系统的益生菌对其深入研究。     

番茄灰霉病菌拮抗细菌B21的鉴定

对分离于叶片表面能较强抑制番茄灰霉病菌生长的拮抗细菌B21菌株进行了鉴定。通过形态特征、生理生化特征观察,利用PCR技术对菌株B2116SrDNA序列作全序列分析,序列结果在GeneBank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析,结果显示B21与已报道的B.subtilis16SrDNA序列(登陆号AY172513)有99.93%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。确定B21为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的一个菌株。     

豆制品(茶干)中致腐菌的分离鉴定

以未灭菌真空包装的新鲜茶干为试验材料,培养使其腐败并分离纯化得到4株主要致腐菌。对其形态和菌落特征、生理生化特性进行了系统的研究,并进行了分类鉴定。初步判断曲为芽孢杆菌科芽孢杆菌属,df2为微球菌科葡萄球菌属,df3为链球菌科链球菌属,硝为瘤胃球菌科瘤胃球菌属。对主要致腐菌df1的16SrDNA与已知序列进行同源性比较,鉴定（1n为芽孢杆菌属苏云金芽孢杆菌,并命名为苏云金芽孢杆菌zhou-1。     

草本纤维提取用菌株的PCR-16S rDNA及ITS-RFLP分析

通过分析从沤麻水中分离到的8株草本纤维提取用菌株的16S rDNA以及ITS序列,鉴定并构建其聚类图,明确草本纤维提取用菌株的遗传关系.通过BLAST比对16S rDNA并用限制性内切酶酶切16～23S的ITS保守序列,对参试菌株的16S rDNA及ITS酶切片段进行聚类分析.结果表明,8株菌株分别属于地表芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及多粘类芽孢杆菌:基于16S rDNA序列与ITS-RFLP所获得的聚类结果基本一致,菌株1251与菌株1172-1聚为一类,其余聚为一类,但种内聚类存在一定的差异,可能与不同类型的序列进化程度有关,8株菌株的16SrDNA序列的相似性为78.66%;Alu Ⅰ、Hinf Ⅰ、Sau3A Ⅰ、Taq Ⅰ 4种限制性内切酶对参试的8株草本纤维提取用产芽孢菌株的ITS进行酶切,各获得0～4条100～440bp的酶切产物.     

猪源高产蛋白酶芽胞杆菌的分离与鉴定

利用酪蛋白培养基从猪粪便样品中分离产蛋白酶的芽胞杆菌,采用福林酚法测定其酶活力,对筛选到的高酶活菌株进行形态学、生理生化和分子鉴定。结果表明,从86株分离茵中筛选了一株酶活较大的菌株B．A464,革兰氏阳性菌,呈粗杆状,能形成卵圆形芽孢,16SrDNA序列长度是1463bp,与蜡样芽孢杆菌的同源性高达99％,鉴定为蜡样芽孢杆菌,所产蛋白酶活力为2．19×10^3U·mL^-1。     

9株芽孢杆菌的初步分离鉴定与拮抗性试验

通过对采集样品中细菌的分离与纯化,获得9株芽孢杆菌,经纯化培养后观察其个体和群体形态特征,并进行了12项生理生化特征鉴定。结果表明,B10为地衣芽孢杆菌,B13为巨大芽孢杆菌,B12、B14为短小芽孢杆菌,B15为苏芸金芽孢杆菌,B16为蕈状芽孢杆菌,B11,B17,B18为蜡样芽孢杆菌。通过对8株植物病原菌和3株动物病原菌的拮抗试验,初步确定B13,B16,B17,B18的抗菌谱较广,其中B10,B15对棉花枯萎菌,B13,B17对辣椒疫霉菌,B11对西瓜枯萎菌,B10,B17,B18对3株动物病原菌有较好的拮抗能力。     

产碱性蛋白酶菌株ZK202的鉴定及其诱变

[目的]为产碱性蛋白酶菌株在生产中的应用提供依据。[方法]从河南省兰考县盐碱地土壤中分离1株产碱性蛋白酶的菌株ZK202,通过形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列分析对其进行鉴定。经紫外照射和DES处理后,测定诱变菌株的酶活力。[结果]菌株ZK202的形态符合芽孢杆菌属的特征,其16SrDNA序列与短小芽孢杆菌的同源性在99%以上。该菌株为短小芽孢杆菌一个新亚种,命名为Bacillus pumilus ZK202,属中等嗜盐菌。ZK202在氯化钠浓度0～12.5%条件下均能生长,以浓度5.0%时最佳。ZK202在碱性环境中生长良好,当培养基pH值在11.0以上时仍能生长,也属嗜碱性菌。经复合诱变后,菌株Zkud202-4发酵液的酶活力达321U/ml,比出发菌株高3.9倍。[结论]Zkud202-4具有稳定的产酶性能,可作为产碱性蛋白酶的突变菌株。     

烟草黑胫病菌拮抗细菌的筛选与鉴定

从烟草根际土壤分离到107个细菌分离物,通过室内平板对峙培养筛选,筛选到13株对烟草黑胫病菌有拮抗作用的菌株,其中,LZ-7菌株的室内平板抑菌效果最好,抑菌圈直径达27.82 mm。经盆栽试验,LZ-7、A3控病作用较好,防治效果分别达59.12%和55.84%。通过16 S rDNA序列测定与分析,LZ-7与Bacillus pumilus的同源性为99%,初步鉴定证明该菌株属于短小芽孢杆菌。     

大豆根腐病生防菌株的筛选及鉴定

采用常规方法从大豆根际分离筛选出105株对大豆根腐病菌有拮抗作用的细菌和放线菌,利用磷脂脂肪酸法和16S rDNA测序鉴定出13株细菌,分别为1株Pseudomonas putida biotype B,1株Pseudomonas chloro-raphis,1株Pseudomonas sp.,4株Bacillus subtilis,2株Bacillus sp.,1株Bacillus pumilus,1株Bacillus atophaeus,1株Virgibacillus pantothenticus,1株Pantoea agglomerans GC subgroup A;10株放线菌,分别为3株Streptomyces violaceusniger violaceusniger,1株Streptoverticillium cinnamoneum,2株Streptomyces halstedii olivaceus,1株Strepto-myces exfoliatus,2株Streptomyces halstedii scabies,1株Streptomyces violaceusniger hygroscopicus ossam。     

一株猪源芽孢杆菌益生菌的筛选与鉴定

以大肠杆菌(Escherichia coli)为病源指示菌,从养猪场健康成年猪粪便中分离、筛选出8株对其有抑菌活性的芽孢杆菌。经培养特征、形态观察、生理生化试验以及16S rDNA序列分析,通过对照《常见细菌鉴定手册》确定L-7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),16S rDNA序列相似度为99.58%,是一株比较理想的潜在益生菌。     

甘露聚糖酶产生菌F1-5的鉴定

[目的]鉴定1株高产甘露聚糖酶菌株。[方法]以高产甘露聚糖酶的菌株为对象,采用形态观察、生理生化试验及16S rDNA系统发育分析手段对其进行鉴定。[结果]该菌株在牛肉膏蛋白培养基上培养24h后,菌落表面粗糙,不透明白色,革兰氏阳性,杆状,能形成芽孢,表明其属于芽孢杆菌属。对F1-5进行生理生化特征鉴定,结果表明,其为枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌。PCR扩增获取该菌的16S rDNA基因。经BLAST同源序列比对,结果显示,菌株F1-516SrDNA与枯草芽孢杆菌的16S rDNA具有99％的同源性,表明F1-5为枯草芽孢杆菌。[结论]该研究为甘露聚糖酶工业化开发应用奠定了基础。     

西瓜枯萎病拮抗细菌HD-5菌株的筛选及鉴定

筛选对西瓜枯萎病病原菌西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl.f.sp.niveum)具有拮抗作用的芽孢细菌.通过对土样中分离的产芽孢细菌进行初筛和复筛,得到一株具有较强抑菌活性的拮抗芽孢细菌HD-5菌株,并对该菌株进行了形态特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA全序列分析.结合HD-5菌株的形态特征、生理生化特性和16 SrDNA全序列分析结果综合考察,判定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).     

生防细菌C 3的鉴定及对魔芋软腐病的防效研究

从魔芋根际土壤中分离得到一株具有强烈抑菌活性,并具有较广抑菌谱的革兰氏阳性生防细菌菌株C3.经形态特征、常规生理生化特征和Biolog鉴定,发现该菌株与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens特征很相似.采用细菌通用引物27f和1 492r扩增16SrDNA基因片段,得到1 105bp DNA片段,其序列与已报道的解淀粉芽孢杆菌FZB42的同源性高达100%,故将生防细菌菌株C3鉴定为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens.田间防效测试结果显示,在对照病情指数为41.20的情况下,生防细菌C3对魔芋细菌性软腐病的控制效果达到了57.76%.     

内生生防菌P1抑菌物质对马铃薯环腐病菌的抗性及鉴定

通过平板对峙法发现菌株P1对马铃薯环腐病菌有很强的抑制作用。经分析,抑菌成分是蛋白质,忍受温度80℃,活性成分在280 nm处有最大吸收峰,分子质量大于10 kDa;通过对菌株形态、生理生化特征以及16S rDNA序列系统发育树分析发现,菌株P1与巨大芽孢杆菌相似度达到100%,确定P1菌株为巨大芽孢杆菌(B.megatherium)。电泳图谱检测该序列由1 391个碱基构成,已在GenBank登录(登录号:FJ823003.1)。     

兔源抗动物腹泻益生菌Tu-1的分离、鉴定及耐受性研究

本研究旨在从健康兔肠道内分离出一株对大肠杆菌有拮抗活性的菌株,并对其鉴定到属。选用平板抑菌圈法,从兔子盲肠中分离得到64株对大肠杆菌有拮抗作用的细菌,对其中14株拮抗作用较强的菌株进行了复筛,其中抑菌圈直径大于20mm的4株,抑菌圈直径在15mm~20mm的8株,另外2株拮抗作用较小,其中Tu-1对大肠杆菌的拮抗作用最强,抑菌圈直径达到21.4mm。在耐受性实验中,Tu-1对酸性环境、胆酸盐和高渗透压均表现出耐受性。对其形态及生理生化特征进行了研究分析,发现与芽孢杆菌相似,将所测得的16S rDNA序列用BLAST软件在GenBank数据库中进行比对,选取序列相似性高的菌株,用Clustal X(1.8)软件进行16S rDNA相似性分析,Neighbor-Joining法构建系统发育树。Tu-1与Bacillus velezensis的相似性水平均达到99.77%,鉴定该菌为Bacillus velezensis。