慢病毒载体介导的APP695过表达SH-SY5Y细胞系的构建和鉴定

目的通过构建pLVX-APP695-PGK-Puro慢病毒载体,用以建立可以稳定过表达APP695蛋白的SH-SY5YAPP695细胞株。方法利用PCR方法扩增目的基因片段APP695,并构建pLVX-APP695-PGK-Puro慢病毒载体,鉴定后将构建好的载体与慢病毒包装系统共转染293T细胞,并以最适感染复数感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,筛选稳转SH-SY5Y-APP695细胞株并用PCR和Western blot鉴定稳转株细胞APP695表达。结果对pLVX-APP695-PGK-Puro载体进行酶切鉴定及DNA测序证明构建过表达APP695的重组慢病毒载体成功,PCR和Western blot显示构建的SH-SY5Y细胞稳转株成功。结论成功构建APP695基因的慢病毒载体并成功构建了SH-SY5Y-APP695细胞株,该载体可在SH-SY5Y细胞株中高水平表达APP695。     

人参皂苷Re对谷氨酸致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

对人参皂苷Re对神经细胞的保护作用并研究其作用机理。建立SH-SY5Y神经细胞谷氨酸损伤模型,用MTT法检测细胞存活率以及选取适宜浓度,用比色法检测丙二醛(MDA)、硝酸还原酶法(NO)和荧光探针负载法检测细胞内活性氧水平(ROS)。由谷氨酸导致SH-SY5Y细胞损伤模型,与模型组做比较,人参皂苷Re可以提高细胞存活率,同时减少由谷氨酸引起的MDA含量、ROS含量和NO含量增加。与对照组比较,模型组细胞存活率下降,MDA含量、NO含量和细胞内ROS水平增加。人参皂苷Re能有效保护谷氨酸损伤的神经细胞,并抑制细胞凋亡,提高神经细胞存活率。     

重组人酸性成纤维细胞生长因子对神经细胞损伤的保护作用

目的建立谷氨酸损伤模型并探讨重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)对谷氨酸损伤神经细胞的干预作用。方法利用流式细胞仪观察rhaFGF对正常培养的神经细胞细胞周期的影响,建立细胞损伤模型,将实验分空白组、模型组和rhaFGF保护组,通过形态观察以及MTT法检测各实验组的细胞活力。结果rhaFGF能促进DNA的合成,谷氨酸对细胞损伤程度随浓度的增大而增大,rhaFGF能够拮抗谷氨酸的神经毒。结论rhaFGF能促进神经细胞生长同时拮抗谷氨酸兴奋性毒性而发挥神经保护作用。     

施磷量及磷锌配施对夏玉米生长发育及籽粒产量的影响

为更好探索小麦/玉米一年两熟种植制度下,夏玉米施肥制度,实现夏玉米抗逆高产丰产。于2010年采用裂区设计,对施磷量及磷锌配施对夏玉米生长发育及籽粒产量的影响进行研究。结果表明：单施磷肥或磷锌配施促进夏玉米生长发育,增加干物质积累和次生根数,降低秃尖、改善穗部性状、提高抗病能,且配施效果优于单施磷肥。单施磷较对照增产幅度为7.70%~31.21%,配施增产15.99%~40.34%,磷锌配施较单施磷肥增产幅度达4.03%~8.73%。其中以施P2O5量在180 kg/hm2时配施15 kg/hm2硫酸锌,产量最高达9581.2 kg/hm2。经回归拟合,单施磷肥和磷锌配施的最佳施P2O5量分别为178.65 kg/hm2和203.49 kg/hm2,籽粒产量可达8823.0 kg/hm2和9499.61 kg/hm2。因此,在施氮基础上,配施磷或磷锌可促进夏玉米生长发育,实现高产抗逆高效栽培。     

小鼠Foxc2质粒载体的构建及功能鉴定

构建pcDNA3.1-Foxc2真核表达载体,并以脂质体转染3T3-L1前体脂肪细胞,探究Foxc2对脂代谢的影响。取孕后15d小鼠腹部脂肪组织提取总RNA,用PCR扩增Foxc2全长序列并连接至pMD18-T载体,测序正确后克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,成功构建pcDNA3.1-Foxc2重组质粒载体。重组质粒转染3T3-L1前体脂肪细胞系,以未转染和空载体转染作为对照,通过RT-PCR和Western blotting法检测Foxc2核酸及蛋白表达,同时检测3T3-L1前体脂肪细胞中脂代谢相关基因FAS、ATGL、HSL及PPARγ的表达。结果显示,重组质粒转染组细胞中Foxc2的核酸和蛋白水平均显著高于对照组。同时发现超表达Foxc2显著降低FAS表达,显著升高HSL及PPARγ的表达,但是对ATGL的表达无显著影响,表明Foxc2具有抑制脂肪沉积的功能。     

鸡bcl-2表达质粒的构建及其对转染细胞凋亡的影响

 构建了 CMV驱动及牛生长激素 poly A加尾信号修饰的 bcl- 2 c DNA真核表达质粒p CDCB1。随后 ,采用脂质体转染方法 ,将扩增并纯化的 p CDCB1转染至培养的 SPF鸡胚次代单层成纤维细胞 (CEF)内 ,96h后收集全部贴壁及上清脱落细胞 ,用 Dotblot检测 bcl- 2的表达 ,用流式细胞术测定其细胞凋亡率。结果 ,p CDCB1转染后 96h,bcl- 2在 CEF中呈高度表达 ;CEF平均凋亡率为 1 .1 4% ,明显低于转染空白载体质粒的对照组 7.64%的凋亡率 ,DNA合成期 (S期 )细胞为 2 1 .58% ,也低于对照组。结果证实鸡 bcl- 2 的表达可显著抑制体外培养 CEF凋亡进程 ,其效应与细胞 DNA合成和增殖无关。     

FoxA1及RNF6在宫颈鳞状细胞癌的表达及意义

目的 探讨FoxA1及RNF6在宫颈鳞状细胞癌的表达及意义。方法 回顾性分析164例宫颈鳞状细胞癌患者(PE组)及164例慢性宫颈炎患者(对照组)的临床资料及保存良好的病理组织标本。采用实时定量PCR技术及免疫组织化学方法检测2组患者病理组织FoxA1及RNF6蛋白、mRNA的表达情况。结果 PE组FoxA1及RNF6蛋白、mRNA表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 FoxA1及RNF6可能通过调节基因表达及蛋白酶作用增强肿瘤细胞增殖、分化,在宫颈鳞状细胞癌生长中发挥重要作用。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达

利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL-2)基因片段,其长度为439 bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL-2基因.再将该IL-2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL-2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致.然后,将IL-2基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,并导入菌株BL21, 经诱导培养、蛋白提取和SDS-PAGE,获得分子量约为42 000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL-2基因在原核细胞中得到表达.     

白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF_2基因真核双表达质粒的构建

应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2) 的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA) 等方法验证基因的表达情况.结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基凶的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2.     

bcl-2/EGFP融合基因真核表达质粒的构建

为深入研究bcl 2对细胞凋亡的调控机制和肿瘤发生发展的影响,应用基因重组手段,根据表达载体pEGFP C1上的多克隆位点和bcl 2基因序列设计了1对引物,对含有bcl 2基因的质粒pWB bcl进行了PCR扩增,得到了708bp的目的片断。将其克隆到pMD18 Tvector,筛选阳性克隆并测序,序列分析表明,其与原初序列同源性达99%。将bcl 2插入到载体启动子下游,与报告基因绿色荧光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein,EGFP)融合,经限制性内切酶酶切和PCR鉴定,证明Bcl 2/EGFP真核表达质粒构建成功。     

鸡白细胞介素-2基因的克隆与酵母表达质粒的构建

从经ConA活化的4周龄岭南黄鸡脾脏淋巴细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡白细胞介素-2(1L-2)cDNA片断,PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体,重组质粒命名为IL-2-T,经菌落PCR与限制酶切鉴定,然后测序,结果表明克隆片断长度为432bp,与预期大小一致,为鸡IL-2基因的编码区全长,将IL-2-T克隆重组质粒进行双酶切(Cla I与Xba I),回收IL-2片断插入同样酶切的毕赤酵母表达质粒pPiCZa-C,构建重组IL-2-C表达质粒,为鸡IL-2在毕赤酵母中的表达奠定基础。     

鸡白细胞介素2真核表达质粒的构建、表达及对AIV疫苗免疫增强作用研究

将鸡白细胞介素2(ChIL-2)基因亚克隆入pCI载体中,pEGFP-N1载体中的EGFP基因酶切后连入质粒pCI-ChIL-2中,构建真核表达质粒pCI-ChIL-2-EGFP,该载体表达ChIL-2-EGFP融合蛋白.重组质粒在脂质体作用下转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)和外周血淋巴细胞(PBLC),荧光显微镜观察到融合蛋白在体外能稳定表达.HI试验显示,pCI-ChIL-2-EGFP与AIV疫苗共注射可明显提高AIV疫苗的免疫原性.     

POR基因敲除、回补及过表达LO2细胞株的构建及作为AFB1染毒模型的初步应用

为了构建POR基因稳定敲除(POR^KO)、回补(POR^CO)、过表达(POR^OE)的LO2细胞株,以便为后续深入开展POR基因在AFB₁致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体,进行慢病毒包装与感染,筛选出LO2 POR^KO单克隆细胞后进行测序及Western blot鉴定。其次用同源重组方法构建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重组质粒,经对POR^KO细胞和野生型细胞转染分别构建LO2 POR^CO及LO2 POR^OE细胞株,以G-418筛选后进行Western blotting鉴定。再用4μmol·L^-1及8μmol·L^-1 AFB₁分别对野生型、LO2 POR^KO、LO2 POR^CO     

pPIC9K-IL-2重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础.     

PCV2和猪伪狂犬病弱毒疫苗体外共接种对猪PBMC中IL-2及IL-6 mRNA表达的影响

将猪圆环病毒2型（PCV2）与猪伪狂犬病弱毒疫苗（PRV）体外单接种和共接种仔猪外周血单个核细胞（PB-MC）,采用real-time PCR技术定量检测接种后不同时间PBMC细胞因子IL-2和IL-6的mRNA表达水平,以分析PCV2对PRV免疫反应的影响。结果显示,PRV接种组PBMC中IL-2与IL-6的mRNA表达均出现显著上调（P〈0.05）,PCV2接种组IL-2与IL-6的mRNA表达在接种后的部分时间也出现显著上调,但PCV2与PRV共接种组的IL-2与IL-6的mRNA表达较PRV组均出现显著下调,表明PCV2能够抑制PRV促进猪PBMC中IL-2与IL-6的mRNA表达上调作用,提示PCV2可能会对PRV的免疫反应产生不利影响。     

人蛋白激酶CK2 α亚基cDNA重组质粒的构建与测序

蛋白激酶ＣＫ２是真核细胞中普遍存在的一种ｃＡＭＰ非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶。它是由两个催化亚基（α或α′）和两个调节亚基（β）组成的不均一四聚体。ＣＫ２α基因具有癌基因作用。ＣＫ２可能是重要的药理靶点，其特异性抑制剂具有潜在的临床治疗价值。目前该酶的...     

犬细小病毒HL-01株的分离鉴定及VP2基因真核表达质粒的构建

从临床发病犬采集粪便样品,以F81传代细胞进行病毒分离,经血球凝集实验(HA)和血球凝集抑制实验(HI)初步鉴定为犬细小病毒。为进一步确诊,根据Genbank中已发表的犬细小病毒VP2基因序列设计并合成一对引物,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出CPV VP2基因,酶切,测序加以鉴定。其序列与国际已发表的CPV-d(type 2)、CPV-1(5 type 2a)、CPV-3(9 type 2b)VP2序列同源性分别为98.97%,98.75%,98.69%,氨基酸序列的同源性分别为98.12%,97.60%,97.60%,从而证明此分离株为犬细小病毒。在获得VP2基因的基础上,为实现VP2蛋白的表达,构建了真核表达质粒pMel BacC-VP2。     

ABP1参与BY2细胞生长素响应的Ca2+信号转导过程

将Ca2+响应实时荧光报告系统引入雌二醇诱导生长素结合蛋白(ABP1)调控表达的BY2细胞中,获得了 ABP1过表达(ABP1-ox)、抑制表达(ABP1-anti)同时对Ca2+标记的几个BY2细胞株.对这些细胞株进行雌二醇诱导调控其ABP1过表达或抑制表达后,分析ABP1的表达量,并通过在细胞外添加IAA处理,实时...     

含CpG序列PRRSV SD2 E基因真核表达载体质粒构建及表达

为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。