脂多糖诱导小鼠肾小管上皮细胞和肺泡巨噬细胞IL-12和TNF-α表达的研究

为了研究脂多糖(LPS)诱导小鼠肾小管上皮细胞和肺泡巨噬细胞IL-12和TNF-α表达的关系,试验采用不同浓度LPS以不同时间体外刺激肾小管上皮细胞(TEC)和肺泡巨噬细胞(AM),用ELISA法分别检测上清液中IL-12和TNF-α的分泌量。结果表明:用2μg/mLLPS刺激TEC,其分泌IL-12的量于24小时达到峰值(P0.01);随着LPS浓度的增加,TEC分泌IL-12的量逐渐增大,当LPS浓度增加到20μg/mL时IL-12的分泌量达到峰值。用10μg/mLLPS刺激AM,AM分泌TNF-α的量于2小时达到峰值(P0.01),随后逐渐下降;随着LPS浓度的变化,TNF-α分泌水平有明显不同。说明在一定的剂量范围内,IL-12和TNF-α的分泌量与LPS呈剂量及时间依赖关系,但随着LPS刺激时间及浓度的增加,IL-12和TNF-α的分泌量逐渐减少;不同浓度的LPS与细胞因子的产生效价有相关性。     

结核分枝杆菌诱导人巨噬细胞和肺泡上皮细胞SOX基因家族的表达差异

研究人SOX基因家族在结核分枝杆菌感染其靶细胞-人巨噬细胞和肺泡上皮细胞中的表达差异。采用结核分枝杆菌强毒株H37Rv感染人U937单核细胞分化的巨噬细胞和A549肺泡上皮细胞,qRT-PCR检测感染后2种细胞内人SOX基因家族的表达变化,并对变化明显的SOX亚族成员进行免疫印迹验证。H37Rv感染诱导人U937巨噬细胞中SOX2和SOX10基因表达上调,但除SOX3和SOX30基因表达不变外,其他SOX基因表达均下调。免疫印迹进一步验证SOX B1和SOX F亚族基因在蛋白质水平全部下调。与H37Rv感染人U937巨噬细胞后SOX基因家族的表达变化不同,H37Rv感染人A549肺泡上皮细胞后,SOX基因家族在转录水平全部上调,尽管免疫印迹显示SOX3和SOX17在蛋白质水平有所下调。本研究最大发现是结核分枝杆菌感染人巨噬细胞后,SOX基因家族表达倾向下调;而感染人肺泡上皮细胞后,SOX基因家族表达普遍上调。这一结果提示人SOX基因家族可能在肺泡巨噬细胞和上皮细胞相互作用于对抗结核分枝杆菌感染中发挥调控作用。     

脂多糖诱导的猪肺泡巨噬细胞中Toll样受体和下游基因的表达

本研究旨在确定Toll样受体(TLRs)和下游基因的表达,以及脂多糖(LPS)刺激的猪肺泡巨噬细胞(AM)中细胞因子的分泌随年龄的动态变化。从5日龄新生仔猪和120日龄幼猪中分离AMs,在无LPS和不同浓度LPS添加条件下培养24 h,用实时定量PCR和ELISA分别对其mRNA的表达和细胞因子进行检测。结果表明,与未刺激的细胞相比,添加不同浓度的LPS均导致TLRs 2、4、5和9 mRNA的上调,其中在不同年龄中TLR4的表达均为最高(P<0.05)。此外,定量分析结果表明,两个年龄阶段编码TLRs 2、4、5和9,LBP、CD14、MD2、MyD88、IRAK4和TRAF6的mRNA表达的增加均呈时间依赖性(P<0.05);LPS诱导的TLR4、LBP、CD14和MyD88 mRNA的表达,新生仔猪显著高于幼龄猪(P<0.05);上清液中细胞因子IL-6和TNF-α的水平随培养时间和动物年龄显著变化(P<0.05)。在两个年龄的猪中,其浓度在LPS刺激1 h后增加,且在48 h时仍差异显著。幼龄猪上清液中的促炎性细胞因子IL-6和TNF-α显着高于仔猪。研究结果表明,TLRs和下游基因的表达随年龄而变化,促炎性细胞因子促进了与年龄相关的肺部感染先天性免疫应答的不同。下一步需要在更大的年龄范围内通过功能研究手段确定LPS对猪AMs的精确影响。     

肺泡上皮细胞减轻巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染中TLR信号介导的炎症反应

本研究模拟体内肺泡的气液相环境,采用肺脏上皮细胞与巨噬细胞的气液相共培养模型,探讨肺脏上皮细胞对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫调节作用。建立人肺泡上皮细胞A549与人单核细胞U937分化而来的巨噬细胞的气液相共培养模型,利用人结核分枝杆菌H37Rv株分别感染A549细胞、U937细胞和共感染A549/U937细胞,然后利用定量反转录PCR(qRT-PCR)、ELISA和Western blot检测巨噬细胞U937中的Toll样受体(TLR)信号分子及其下游炎症因子的表达变化。结果显示,H37Rv分别感染共培养模型中的A549细胞和U937细胞都能明显上调U937巨噬细胞中TLR信号分子TLR2、TLR4、TLR6、TLR8、MyD88和TRAF6,及其下游炎症因子NFκB、TNFα、IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10和IL-12α的表达;但当H37Rv共感染上皮细胞和巨噬细胞,H37Rv诱导的U937巨噬细胞的上述因子表达较单独其感染的巨噬细胞显著下降。结果表明,在上皮细胞和巨噬细胞共培养体系中,结核分枝杆菌H37Rv分别感染人A549上皮细胞和U937巨噬细胞都能激发巨噬细胞的TLR信号及其下游的炎症反应,但2种细胞共感染H37Rv,上皮细胞感染后能够降低巨噬细胞的TLR信号活性,并减轻后者的炎症反应。由此可见,肺泡内上皮细胞与巨噬细胞之间可能存在某种相互调控机制,避免抗感染过程中的过度炎症反应以保持肺泡内细胞的组织及其功能的稳态。     

马兜铃酸Ⅰ诱导肾小管上皮细胞凋亡的检测

本试验旨在培养小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs),探讨马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AAⅠ)诱导小鼠肾小管上皮细胞的凋亡情况。AAⅠ与RTECs反应后,从细胞形态学、DNA Ladder、流式细胞仪3个方面检测AAⅠ诱导RTECs的凋亡情况。AAⅠ作用后,随着浓度的增高,上皮细胞失去上皮细胞表型,在20~80 μg/mL作用24 h后,细胞都出现晚期凋亡的特征;在20 μg/mL AAⅠ的作用下早期凋亡的比率随作用时间的延长而增高。AAⅠ可诱导小鼠原代RTECs产生凋亡,凋亡随着作用时间的延长和药物浓度的增大而加剧。     

低氧诱导因子-1α对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响

本研究旨在探讨低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化（EMT）的影响。首先对牦牛肾小管上皮细胞进行培养鉴定,并选取第三代细胞对其分别进行药物处理（DMOG组）和不做药物处理（对照组）,检测EMT相关基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,并观察细胞形态变化。结果表明：使用Ⅰ+Ⅱ型胶原酶可以更好地获得肾小管上皮细胞;免疫荧光结果细胞CK18表达呈阳性,Vimentin和CD31呈阴性表达;qRT-PCR和Western blot结果表明,DMOG组中的HIF-1α,TGF-β1,α-SMA在mRNA和蛋白水平均较对照组有极显著增加（P<0.01）,而E-cadherin的表达显著降低（P<0.05）;经药物干预后,细胞形态由铺路石样转变为长梭形,经鉴定长梭形细胞为间质细胞。本研究成功建立了牦牛肾小管上皮细胞的分离培养体系,并发现HIF-1α表达上调可以促进牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化。     

活性氧参与脂多糖诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7活化诱导凋亡

研究活性氧(ROS)与脂多糖(LPS)诱导后巨噬细胞活化诱导凋亡的关系。体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用不同浓度LPS诱导细胞,添加100μmol/L H2O2增加细胞内ROS,或用姜黄素(7.5μmol/L)降低细胞内ROS;流式细胞术分析细胞凋亡、线粒体膜电位(MMP)和ROS。结果显示,RAW264.7细胞凋亡和细胞内ROS水平均随LPS浓度增加而增加,高浓度的LPS导致MMP下降;与LPS(8μg/m L)单独作用组比,H2O2增加ROS,并导致凋亡细胞百分率增加;姜黄素降低LPS诱导的细胞凋亡,同时减少细胞内ROS。表明活性氧参与LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7活化诱导凋亡。     

细胞外高钙对鸡肾小管上皮细胞活力和NO产生的影响

为探讨一氧化氮（NO）在高钙致鸡痛风中的作用，利用已建立的鸡原代肾小管上皮细胞的体外研究模型，经不同浓度的钙进行处理．通过MTT比色法观察了高钙对细胞活性的影响；采用硝酸还原酶法测定了不同浓度高钙处理原代肾小管上皮细胞后培养上清液中亚硝酸根／硝酸根（NO2^-／NO3^0）的含量（NO的静态氧化形式）。结果表明，分别用4．0mmol／L（试验组Ⅰ），8．0mmol／L（试验组Ⅱ），12．0mmol／L（试验组Ⅲ），16．0mmol／L（试验组Ⅳ）Ca^2＋处理细胞，各时段组的细胞活性与对照组相比均显著降低（P〈0．01），且细胞外钙浓度越高，细胞活性降低越明显。高钙处理细胞24h后．各组培养液中NO的含量较对照组升高不显著；48h后，试验Ⅳ组的NO比对照组显著升高；72h后，各试验组与对照组相比NO的含量均显著升高。这些结果说明，细胞外高钙能够直接损害肾小管上皮细胞，而NO可能在肾小管上皮细胞的损害中起一定的作用。     

Arkadia表达载体转染肾小管上皮细胞条件的优化

本试验旨在优化泛素化酶Arkadia质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo转染小鼠肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells,RTECs)的条件,为研究Arkadia表达载体在小鼠马兜铃酸肾病(aristolochic acid nephrohathy,AAN)中的作用奠定基础。以小鼠RTECs为转染对象、脂质体Lipofectamine^TM 2000为转染介质,采用Real-time PCR和CCK-8法检测不同的质粒与脂质体比例条件下Arkadia mRNA的表达差异及对细胞活性的影响;同时,用Real-time PCR检测不同的转染时间条件下表达载体对Arkadia mRNA沉默效果的差异。结果显示,Arkadia-pGPU6/GFP/Neo载体的转染效率表现出了一定的剂量和时间依赖性。当质粒DNA∶Lipofectamine^TM 2000为0.66 μg∶2 μL、转染时间为24 h时,对Arkadia mRNA表达的抑制最明显并且对细胞的毒性最小。最终确定了Arkadia-pGPU6/GFP/Neo载体转染小鼠RTECs的最佳条件。     

脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞中炎性因子和核转录子-κB的表达

试验预探索脂多糖(LPS)刺激奶牛乳腺上皮细胞炎性因子产生时间、浓度以及其对NF-κB信号通路的激活情况。用酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞(b MEC);CCK-8法筛选LPS最佳刺激浓度(IR≤10%),并用其处理对数期生长的b MEC。ELISA试剂盒检测0~24 h不同处理时间细胞培养液上清中TNF-α和IL-1β表达变化,以确定炎症模型是否建立成功;用Western-Blot检测核转录因子NF-κB(p-p65和p65)及其抑制蛋白(p-IκBα和IκBα)的表达。结果显示,用酶消化法成功培养原代b MEC;CCK-8法筛选LPS的最佳致炎浓度为1μg/m L;LPS处理后3~24 h可极显著增加奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α和IL-1β表达,并在处理后15 min极显著提高b MEC中p-p65和p-IκBα的表达。上述结果说明,LPS能够在3~24 h内有效诱导b MEC炎症模型的建立,并能在15 min时活化奶牛乳腺上皮细胞中的NF-κB信号通路。     

奶牛肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

为建立奶牛肾小管上皮细胞的原代培养、传代以及鉴定方法,本研究将肾脏皮质剪碎,并网筛过滤选取肾小管后分别进行直接培养、胶原酶1消化培养、胰蛋白酶消化培养和胰蛋白酶和0．02％EDTA混合消化培养,分别应用上述四种方法进行原代培养和传代培养,然后采用CK-18、PCK和Vimentin三种蛋白进行免疫组化鉴定奶牛肾小管上皮细胞。结果表明,采用消化培养方法都能够得到奶牛肾小管上皮细胞,但是胶原酶1消化得到的活细胞更多,能更快地成功培养奶牛肾小管上皮细胞。胶原酶1消化法是培养奶牛肾小管上皮细胞的理想培养法。     

PYY对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6分泌的影响

为明确PYY对巨噬细胞炎性细胞因子分泌的调节作用,本试验分离培养健康小鼠腹腔巨噬细胞,不同浓度PYY预处理后,以LPS刺激。ELISA方法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-6含量,半定量PCR方法检测细胞中TNF-α、IL-6mRNA表达变化。结果显示:高浓度的PYY1-36(10-9¹0-7 mol/L)和PYY3-36(10-810-7 mol/L)和PYY3-36(10-8¹0-7 mol/L)对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α分泌具有显著抑制作用(P<0.05);PYY1-36对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞IL-6分泌无明显作用(P>0.05);不同浓度PYY3-36(10-1110-7 mol/L)对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α分泌具有显著抑制作用(P<0.05);PYY1-36对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞IL-6分泌无明显作用(P>0.05);不同浓度PYY3-36(10-11¹0-7 mol/L)对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞IL-6分泌均具有显著抑制作用(P<0.05)。表明PYY对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α及IL-6的分泌具有一定的抑制作用,提示PYY可能通过抑制炎性细胞因子的分泌而抑制炎症性疾病的发生发展。     

PYY对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6分泌的影响

为明确PYY对巨噬细胞炎性细胞因子分泌的调节作用,本试验分离培养健康小鼠腹腔巨噬细胞,不同浓度PYY预处理后,以LPS刺激。ELISA方法检测细胞培养上清中TNF-α、IL-6含量,半定量PCR方法检测细胞中TNF-α、IL-6mRNA表达变化。结果显示：高浓度的PYY1-36（10-9-10-7 mol/L）和PYY3-36（10-8-10-7 mol/L）对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α分泌具有显著抑制作用（P〈0.05）;PYY1-36对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞IL-6分泌无明显作用（P〉0.05）;不同浓度PYY3-36（10-11-10-7 mol/L）对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞IL-6分泌均具有显著抑制作用（P〈0.05）。表明PYY对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α及IL-6的分泌具有一定的抑制作用,提示PYY可能通过抑制炎性细胞因子的分泌而抑制炎症性疾病的发生发展。     

PDGF-B基因沉默对LPS介导小鼠乳腺上皮细胞分泌IL-6和TNF-α的影响

旨在观察PDGF-B基因沉默对LPS诱导小鼠乳腺上皮细胞分泌IL-6和TNF-α的影响,为揭示乳腺上皮细胞的免疫机制提供参考数据。采用siRNA转染技术对PDGF-B基因进行沉默,用实时荧光定量RT-PCR方法筛选最佳转染条件,并检测沉默后LPS介导其下游信号PI3K mRNA的表达量,用ELISA法检测其下游信号PI3K蛋白含量和LPS介导细胞分泌前炎症细胞因子IL-6和TNF-α的含量。结果显示,选用PDGF-B-mus-886片段的50nmol/L浓度转染组能极显著抑制PDGF-B的mRNA表达(P0.01);PDGF-B沉默后,LPS刺激下其下游PI3K的mRNA和蛋白表达量与对照组相比均呈显著性降低(P0.05);细胞分泌IL-6的量与对照组相比呈显著性降低(P0.05),而分泌TNF-α的量各组无显著性变化(P0.05)。结果表明,PDGF-B可引起LPS介导乳腺上皮细胞IL-6分泌量的改变,因此,PDGF-B可作为靶基因深入研究乳腺上皮细胞的免疫功能,为乳腺炎症、肿瘤等相关乳腺疾病的治疗提供新的思路及试验数据,为新药的开发和应用提供理论依据。     

牛分支杆菌Mce4A蛋白对牛肺泡巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-6和IL-12表达的影响

牛分支杆菌侵入巨噬细胞的机制,主要是由哺乳动物细胞侵袭蛋白(Mammalian cell-entry proteins,Mce)介导的,在牛分支杆菌的致病机理中具有重要的作用。为了探讨Mce4A蛋白在牛分支杆菌致病机理中的作用,用不同浓度的重组Mce4A蛋白刺激肺泡巨噬细胞,结果显示,Mce4A蛋白抑制巨噬细胞的活性;用重组Mce4A蛋白、MtbPPD、MbPPD和BCG刺激肺泡巨噬细胞,结果表明,Mce4A蛋白促使肺泡巨噬细胞TNF-α、i NOS和IL-6的表达上调,而对IL-12的表达没有影响。MbPPD和BCG促使肺泡巨噬细胞TNF-α、i NOS、IL-6和IL-12的表达上调;MtbPPD促使肺泡巨噬细胞TNF-α、IL-6和IL-12的表达上调,但是对i NOS的表达却没有影响。由此可见,Mce4A蛋白能够促使巨噬细胞分泌炎性细胞因子,促使机体发生炎性反应,在宿主细胞免疫应答反应中具有重要的作用。     

TGF-β1和Smad4及Smad7基因在体外培养的小鼠原代肾小管上皮细胞中表达情况的检测

采用肾小管节段贴块法培养小鼠原代肾小管上皮细胞,用免疫细胞荧光染色法鉴定细胞种类,并用RT-PCR检测了原代肾小管上皮细胞中TGF-β1、Smad4和Smad7基因的表达情况.结果表明,TGF-β1、Smad4和Smad7基因在肾小管上皮细胞中均有表达.这为探讨上述基因在肾间质纤维化中的作用奠定了基础.     

诱导猪肺泡巨噬细胞CD163受体表达的细胞因子筛选

猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)中的CD163受体作为明星分子不仅参与正常的生理活动,而且作为重要的病毒受体介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)入侵宿主靶细胞,因...     

SD大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

采用机械研磨、筛网过滤和酶消化相结合的方法获取肾小管节段进行原代培养,以免疫组织化学法和细胞化学染色法鉴定培养细胞。结果表明,肾小管上皮细胞围绕肾小管节段呈岛屿状向四周逐渐生长并于第4~7天处于对数生长期,培养细胞角蛋白ck18表达阳性,碱性磷酸酶染色阳性,证实培养细胞为近端肾小管上皮细胞,且纯度较高。     

细菌脂多糖诱导巨噬细胞NO信号分子释放的研究进展

本文主要综述了有关细菌脂多糖诱导巨噬细胞释放一氧化氮信号分子及其诱导巨噬细胞释放一氧化氮的可能机制.细菌脂多糖可能通过酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶C、神经酰胺介导巨噬细胞的丝裂原活化蛋白激酶和核转录因子途径,诱导一氧化氮合酶的生成来影响其一氧化氮信号分子的释放.其中,丝裂原活化蛋白激酶也可能是细菌脂多糖诱导核转录因子途径中...     

不同浓度乙醇洗脱沙葱黄酮对脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的抗炎作用

本试验旨在研究通过超声波法提取的35%和75%乙醇洗脱沙葱黄酮对脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的抗炎作用。采用细胞计数试剂盒检测不同添加浓度(25、50、100、200、400μg/mL)的35%或75%乙醇洗脱沙葱黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响;设空白对照组、LPS应激模型组、不同浓度乙醇洗脱沙葱黄酮组(分别加入25、50、100μg/mL 35%或75%乙醇洗脱沙葱黄酮溶液),采用Griess、实时荧光定量PCR及酶联免疫吸附测定法检测不同浓度乙醇洗脱沙葱黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子及炎性因子的影响。结果表明:与空白对照组相比,35%、75%乙醇洗脱沙葱黄酮在25～100μg/mL添加浓度内可极显著提高小鼠腹腔巨噬细胞活性(P0.01)。与LPS应激模型组相比,35%、75%乙醇洗脱沙葱黄酮均可极显著极显著降低小鼠腹腔巨噬细胞一氧化氮含量及诱导型一氧化氮合酶mRNA相对表达量(P0.01),并均呈剂量依赖效应,且75%乙醇洗脱沙葱黄酮作用效果优于35%乙醇洗脱沙葱黄酮; 35%乙醇洗脱沙葱黄酮可极显著降低小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量(P0.01),极显著降低TNF-α、IL-6 mRNA相对表达量(P0.01); 75%乙醇洗脱沙葱黄酮可显著或极显著降低小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α含量(P0.05或P0.01),极显著降低TNF-α、IL-6 mRNA相对表达量(P0.01)。由此可见,35%、75%乙醇洗脱沙葱黄酮可通过提高小鼠腹腔巨噬细胞活性、调控细胞因子及炎性因子的分泌而发挥抗炎作用。