豆类活性肽PA1b在大肠杆菌中的多拷贝串联表达

为构建能表达串联豆类活性肽PA1b(pea albumin 1 subunit b)基因的重组大肠杆菌,并进行诱导表达和产物纯化。通过合成PA1b基因,采用同尾酶技术构建1～4拷贝数的串联PA1b基因,分别克隆至pET32a(+)原核表达载体上,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,亲和层析纯化融合蛋白,肠激酶切除融合标签和切开串联体,获得单体PA1b肽。结果显示,大肠杆菌转化子中的重组质粒pET32a(+)-nPA1b(n=1～4)经PCR及测序验证正确,经1 mmol/L IPTG 25℃诱导8 h,均能以包涵体形式表达出重组融合蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,串联拷贝数越多,融合蛋白中PA1b含量越高。Ni-NTA亲和纯化得到高纯度的4拷贝串联PA1b融合蛋白,经肠激酶充分酶切、超滤浓缩后获得重组PA1b多肽。获得了表达1～4拷贝串联PA1b基因的重组大肠杆菌,并通过酶解4拷贝PA1b融合蛋白制备了重组PA1b,为多拷贝法制备PA1b肽奠定基础。     

胰岛功能测定与β细胞总量分析

胰岛β细胞总量分析有助于准确评价胰岛功能,监测疾病的发展,评价药物治疗效果,经典的形态学分析方法限制了胰岛β细胞总量分析的应用。研究提示,胰岛功能与胰岛β细胞总量存在相关性,通过β细胞功能分析可以估计胰岛β细胞总量。在不同程度胰岛损伤的实验动物和临床患者进行的一系列研究表明,静脉精氨酸引起的急性胰岛素反应(AIRarg)和最大急性胰岛素反应(AIRargMax)显著相关于胰岛β细胞总量,r值均在0.80左右。通过测定AIRarg和AIRargMax,可以非侵入性地定量分析胰岛β细胞总量,也为建立人体内BCM估计的数学模型奠定基础。     

植物多肽激素PAlb的纯化鉴定及功能研究

通过稀醋酸低温浸提、海藻酸吸附、盐析、SephadexG25凝胶过滤、Sephacel离子交换层析和高效液相色谱等方法，从豌豆种子中分离纯化出PAlb及其多种异构体，并通过质谱和氨基酸测序进行了鉴定，结果表明：PAlb能抗胃蛋白酶（pepsin）水解，其高度的酶稳定性是由于分子内具有胱氨酸结构模体。此外，PAlb能明显延长体外培养的胰岛β细胞的存活时间，并影响胰岛β细胞的功能。     

PDX-1对胰岛β细胞增殖、分化及胰岛素分泌作用的研究进展

胰腺-十二指肠同源盒1(PDX-1)是在胰腺发育中起重要作用的转录因子。小GTP酶Ran、β2肾上腺素受体等物质可通过调节PDX-1基因的表达来影响胰岛素的合成。此外,PDX-1可诱导非胰岛细胞如骨髓间充质干细胞、脂肪源性干细胞等向胰岛素分泌细胞分化,提示PDX-1在胰岛β细胞再生,促进胰岛β细胞恢复中有着巨大潜能。     

Activin A诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞

[目的]研究Activin A体外定向诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞的作用,为移植体外新生β细胞治疗宠物犬糖尿病打下基础,同时为胰岛细胞体外再生培养的优化提供科学依据.[方法]采用培养液RPMI-1640+10%FBS+10 ng/mL EGF+1%青霉素—链霉素扩增大鼠胰腺导管干细胞至单层,空白对照组加基础培养液,诱导组在基础培养液中分别添加5、10、15和20 ng/mL Activin A,连续培养28 d.诱导培养期间于倒置显微镜下观察细胞形态变化,诱导结束后通过双硫腙(DTZ)染色、细胞免疫荧光染色、ELISA检测及实时荧光定量PCR等方法对分化形成的类胰岛细胞团功能和性状进行验证.[结果]大鼠胰腺导管干细胞经Activin A诱导分化形成球形细胞,并聚集成团(类胰岛),DTZ染色结果均呈阳性.诱导28 d后,20 ng/mL Activin A诱导组的类胰岛细胞团数量及其Insulin基因表达水平均极显著高于其他3个Activin A诱导组(P<0.01,下同),且类胰岛细胞体积最大,类胰岛细胞的Pdx1基因表达水平最高;无论在低葡萄糖(5 mmol/L)还是高葡萄糖(25 mmol/L)的刺激下,20 ng/mL Activin A诱导组类胰岛细胞的Insulin和C-peptide分泌量均极显著高于其他3个Activin A诱导组.[结论]Activin A能体外诱导大鼠胰腺导管干细胞分化形成胰岛β细胞,且以基础培养液中添加20 ng/mL Activin A的诱导效果最佳.     

EETs对胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌的影响

本实验旨在分析不同浓度的EETs对胰岛β细胞的影响,为防治2型糖尿病提供理论依据。体外培养MIN6小鼠胰岛瘤细胞,经不同浓度EETs处理细胞后,分别采用CCK-8法和ELISA法检测细胞活性和胰岛素含量。浓度为100 nM的11,12-EET和14,15-EET对胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌能力具有显著促进作用。100 nM11,12-EET和14,15-EET均显著增加胰岛β细胞的增殖以及其胰岛素分泌能力。     

PDX-1基因对人胚肾细胞胰岛发育相关基因表达的影响

【目的】研究人PDX-1基因对胰岛发育相关基因和胰岛素基因(Insulin,INS)表达的影响,探讨PDX-1基因诱导非β细胞为胰岛素分泌细胞的可能性。【方法】采用PCR扩增技术,从人的胰腺cDNA中扩增PDX-1基因和INS基因的阅读框架,分别构建了质粒pAAV-PDX-1和pAAV-INS;将pAAV-PDX-1转染人胚肾细胞(293T)48 h后,RT-PCR检测293T细胞中胰岛发育相关基因的表达;再将pAAV-PDX-1和pAAV-INS共转染293T细胞48 h后,RT-PCR检测293T细胞中INS的表达。【结果】转染pAAV-PDX-1的293T细胞中,检测到胰岛发育相关基因PDX-1、Ngn3、PC2、BETA2的表达;PDX-1没有直接增强INS基因表达的作用。【结论】在293T细胞中,PDX-1基因对胰岛发育相关基因的表达有重要影响,PDX-1在诱导非β细胞为胰岛素分泌细胞的过程中可能有着重要的作用。     

竞争抑制ELISA法检测植物中豌豆胰岛素PA1b

为研究豌豆胰岛素PA1b在植物生长发育中的作用,利用竞争抑制ELISA法,检测PA1b在豌豆、芋头、姜、西红柿、苦瓜、蒜头、洋葱、丝瓜、黄瓜等植物中的分布,以及PA1b在豌豆种子发芽过程中的含量变化。结果显示PA1b在豌豆中含量最高,且随着豌豆种子发芽时间的增加含量逐渐减少,PA1b可能对植物生长发育起调控作用。     

GDF9与BMP15受体基因在异育银鲫卵细胞中的表达

转化生长因子9(GDF9)与骨形成蛋白15(BMP15)通过受体介导途径,在鱼类卵细胞发育与成熟过程中发挥着重要作用。在GDF9与BMP15信号通路中,GDF9与BMP15的Ⅰ型受体基因分别为TGF-βR1a、TGF-βR1b和BMPR1Ba、BMPR1Bb,两者的Ⅱ型受体基因均为BMPR2a、BMPR2b。本研究以异育银鲫为实验对象,对GDF9和BMP15的各受体基因在卵细胞中的表达模式进行研究。结果显示,在异育银鲫卵细胞发育过程中,TGF-βR1a、BMPR1Ba与BMPR1Bb基因mR NA水平呈先降低后升高的变化趋势,TGF-βR1b基因mR NA水平自Ⅱ期卵细胞开始显著升高,而BMPR2a与BMPR2b mR NA水平则随着卵细胞的发育逐渐降低。同时,TGF-βR1b、BMPR1Bb、BMPR2a及BMPR2b mR NA主要在滤泡细胞中表达,TGF-βR1a与BMPR1Ba mR NA则在卵母细胞与滤泡细胞中均有表达。以上研究提示,GDF9与BMP15可通过与其受体结合,以旁分泌或自分泌参与调控硬骨鱼类卵细胞的发生、发育与成熟。     

三氯化铬对大鼠胰岛细胞活性及胰岛素分泌的影响

为了研究三氯化铬与大鼠胰岛细胞共培养对胰岛细胞活性与胰岛素分泌水平的影响,并对其影响机制进行探讨,以台盼蓝染色法和MTT法检测胰岛β细胞活性,以不同浓度葡萄糖刺激胰岛素释放评价三氯化铬对胰岛细胞功能的影响,同时以RT-PCR检测胰岛细胞的抗凋亡基因bcl-2的表达。结果发现,随培养液中三氯化铬浓度的增加,胰岛活性随之增加,凋亡率降低,但2.0μmol/L的活性有所降低,凋亡率与对照组没有显著差异(P>0.05)。低糖和高糖浓度环境中试验组与对照组的胰岛素分泌没有显著差异(P<0.05),RT-PCR发现试验组的bcl-2表达显著高于对照组(P<0.05)。2.0μmol/L CrCl3明显降低胰岛细胞的凋亡率,提高其存活率,改善胰岛功能。