嗜水气单胞菌HEC毒素基因的克隆及酶谱分析

嗜水气单胞菌ＨＥＣ毒素是该菌重要的致病因子和保护性抗原。为了解其分子生物学特性，用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取了嗜水气单胞菌Ｊ－１株的染色体，经ＥｃｏＲＩ酶切、琼脂糖凝胶电泳后作Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ，用ＤＩＧ标记的ＨＥＣ毒素探针检测，其５．０ｋｂ的酶切片段呈阳性。回收该片段，与ｐＵＣ１９相连，转化大肠杆菌ＪＭ１０９。提取Ｘ－ｇａｌ平板上白色菌落的质粒，经大小比较、ＥｃｏＲＩ酶切分析及ＤＩＧ标记ＨＥＣ毒素核酸探针斑点杂交鉴定，获得ｐＨＥＣ１１等含５．０ｋｂ目的ＤＮＡ片段的重组质粒。ｐＨＥＣ１１质粒经酶切、电泳，证实目的ＤＮＡ片段中含有ＢａｍＨＩ、ＳｍａⅠ、ＰｓｔⅠ及ＰｖｕⅡ等酶切位点，并绘制了其物理图谱。同时还构建了若干亚克隆，为研制嗜水气单胞菌基因工程苗提供了目的基因片段。     

用PCR检测嗜水气单胞菌毒素基因

选取气单胞菌毒素基因中保守区的同源寡核苷酸序列为引物，用PCR技术检测临床分离的嗜水气单胞菌的毒素基因。扩增产物中均含有明显的预定条带；用AluI和AvaI酶切进一步鉴定，其酶切片段的数量和大小均与设计相吻合，证实样本中带有毒素基因。细菌在鲜血平板上呈现党大的β－溶血圈，用相应的单克隆抗体检测培养上清中的毒素，亦获阳性结果，进一步证实PCR技术检测气单胞菌毒素准确可靠。     

嗜水气单胞菌亚单位疫苗的研制

首先提纯嗜水气单胞菌Ｊ－１株的外毒素一ＨＥＣ毒素和脂多糖，进而将脂多糖脱去类脂Ａ，再用ＥＤＣ法将ＨＥＣ毒素与多糖偶联。偶联物经双抗体夹心ＥＬＩＳＡ和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析鉴定确认，ＨＥＣ毒素与多糖的偶联比为１：１．３。偶联物作为亚单位苗，对小鼠和鲫鱼均无毒性，能诱导免疫小鼠和鲫鱼产生坚强的保护，对同源菌株的攻击保护率，小鼠１００％，鲫鱼８３％。与嗜水气单胞菌的全菌苗和毒素苗相比，亚单位苗诱导的抗体出现早，滴度高，持续时间长。     

鱼类嗜水气单胞菌的几种检测方法

本文介绍了7种嗜水气单胞菌的检测方法,分析了不同检测方法的可取之处及不足,供做该项检测工作的人士参考。     

嗜水气单胞菌检测技术研究进展

嗜水气单胞菌是重要的水生动物病原菌,也是重要的人兽共患病原菌。近年来,其检测技术取得了迅速发展。论文对嗜水气单胞菌的检测技术进行了综述,并对其检测新策略进行了展望。     

Dot-ELISA法检测致病性嗜水气单胞菌

在鱼类致病性气单胞菌诊断试剂盒的基础上,用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)检测致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)胞外蛋白酶ECPase54,同时用脱脂奶平板、PCR特异性扩增气溶素基因aer和16S rRNA基因检测72株气单胞菌分离株.结果显示致病性嗜水气单胞菌检测阳性率分别如下:Dot-ELISA法90.3％(65/72)、脱脂奶平板法75％(54/72)、aer基因PCR法94.4％(68/72)、16S rRNA PCR法81.9％(59/72),Dot-ELISA与其他3种方法的符合率分别为79.2％(57/72)、91.6％(66/72)、81.9％(59/72).在ECPase54兔抗血清制备后的2、4、6、12、18个月,用Dot-ELISA检测72株分离株,检测结果重复性好.结果表明Dot-ELISA法敏感、特异、实用,可用于鱼类致病性Ah的临床诊断.     

嗜水气单胞菌研究进展

嗜水气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属,在自然界分布广泛,可以感染多种水生及陆生动物并引起不同的疾病,是一种重要的人—兽—鱼共患病病原菌,本文概述了嗜水气单胞菌的分类地位和生物学性状,并对其鉴定方法、致病因子和由其引起的疾病进行了综述。     

致病性嗜水气单胞菌PCR快速检测方法的建立

本试验根据GenBank已登录的致病性嗜水气单胞菌保守序列16S rDNA和Aero,设计2对引物,以嗜水气单胞菌纯培养物为起始材料,建立PCR检测方法。从12株分离物中均扩增到16S rDNA片段,从3株分离物中均扩增到Aero片段,经序列测定和分析,所扩增的片段均为嗜水气单胞菌的核苷酸序列。结果表明,建立的PCR方法可用于检测致病性嗜水气单胞菌。     

间接血凝诊断家畜日本血吸虫病试剂的改进研究

目的提供便于在现场诊断家畜血吸虫病的试剂。方法在原"间血"国家标准的基础上,将提取虫卵方法改为胰蛋白酶和胶原酶消化的方法,并将水剂抗原改为冻干抗原制备。结果按改进方法制备的诊断试剂(冻干)提高了诊断的准确性,阳性和阴性符合率均在95%以上,达到了诊断试剂检测家畜血吸虫病的药政要求[1],且更易保存。结论按新方法制备的诊断试剂可作为我国疫区家畜血吸虫病检测和传播阻断地区疫情监测的首选。     

银加强胶体金技术检测猪细小病毒的研究

本研究首次成功地建立了检测猪细小病毒（ＰＰＶ）抗原的银加强胶体金检测法（ＳＥＣＧＡ），并确定了操作流程中的最佳试验条件。应用该法对纯化ＰＰＶ抗原的最低检出量为０．３１２５ｎｇ／点，其敏感性分别为间接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＨＡ的８倍和１０００倍。特异性阻断试验和交叉反应试验证明ＳＥＣＧＡ具有较高的特异性。２０份样本ＳＥＣＧＡ的检测结果与病毒分离和鉴定结果完全相符。ＳＥＣＧＡ和间接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ对７７份样本检测的阳性率分别为８３．１％和８０．５％，其阳性符合率为９６．９％。研究结果表明本法具有经济、敏感性、特异性强等优点，可用于ＰＰＶ感染的特异诊断。为胶体金技术应用于畜禽传染病的诊断和研究奠定基础。     

大豆胰蛋白酶抑制因子酶联免疫吸附测定方法的研究

本研究以纯化的大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子（KTI）为抗原，对兔子进行35天免疫得到了兔抗KTI血清。分别用辣根过氧化物酶（HRP）标记纯化的抗原与抗体，制备了标记适度的酶标抗原与酶标抗体。建立了3种检测KTI含量的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，即酶标抗原竞争、酶标抗体直接抑制和问接抑制法。结果表明，抑制率在20％～70％范围之内，3种方法得到的标准曲线均呈现良好的线性关系（r＞0．96），且检测下限均低于20ng／ml。根据得到的标准曲线，用酶标抗原竞争ELISA法测定了不同温度热处理的KTI中剩余活性部分的含量。结果表明，ELISA法与酶化学分析法的测定结果高度相关（r＝0．99），同时样品添加的回收率试验误差小于10％。酶标抗原竞争法还被用来测定了不同温度热处理的大豆和熟豆粕、全价饲料等几种大豆产品中KTI的含量。以上结果说明，用ELISA法检测生大豆和不同热加工形式的大豆产品中的剩余KTI含量是可行的。     

应用间接荧光抗体染色法监测鸡传染性支气管炎抗体的研究

本文对间接荧光抗体染色法监测鸡传性支气管炎抗体进行了研究。试验结果表明感染鸡性染性支气管炎病毒的鸡成纤维细胞（ＣＥＦ）不适宜做ＩＦＡ方法的抗原，而感染ＩＢＶ后３６－４８小量的鸡胚肾细胞制做ＩＦＡ抗原效果很好。应用１０％犊牛血清封闭并适当改进洗涤条件要非特异性荧光。本试验将所建立的ＩＦＡ方法与美国ＫＰＬ生产的ＩＢＶ－ＥＬＩＳＡ进行了比较。应用ＩＦＡ方法第七天查出血清抗体。通过对十二个鸡群进行流行病调     

间接法Dot－ELISA检测鸡败血支原体（MG）抗原的研究

本文首次建立了检测鸡败血支原体（ＭＧ）抗原的间接法Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ。ＭＧ抗原的最低检出量为７．８１×１０￣４ＣＦＵ／ｍｌＭＧ人工及自然感染样本的抗原检测结果与ＭＧ分离的符合率分别为８４．６％和９２．９％。间接法Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测抗原经济、快速、操作简便，有较好的敏感性、特异性和重复性，能检出ＭＧ人工及自然感染病鸡的带菌情况，适合于大规模抗原样本的检测，可以用作疫病早期诊断的依据和进行流行病学调查。     

反刍动物瘤胃微生物酶类膜消化（触壁消化）的研究

本试验旨在探明反刍动物前胃内是否存在由微生物酶类参与的膜消化。在初生牛犊的前胃上皮,未发现蛋白酶和脲酶的活力。但在成年水牛和湖羊的前胃三室上皮,都不同程度地存在着这些消化酶。成年牛瘤胃还有上皮和腔之间尿素分解的正协同效应及纯化蛋白酶的上皮吸附效应,用15000倍扫描电镜观察,发现前胃上皮乳头表面有许多微突起,它们由可吸附酶分子的多糖层履盖,且成年动物的糖层较厚。由此推断,有活力的消化酶能借助于前胃的特殊结构,和与之接触的食糜发生膜消化。     

不同种、株鸡球虫DNA多态性的比较研究

对鸡的４种球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｉ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ）基因组ＤＮＡ进行ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）比较分析，发现多数引物能使不同种球虫产生完全不同的谱带，因此证明ＲＡＰＤ技术完全可用于同宿主艾耳球虫虫种的分类鉴定。并应用ＲＡＰＤ技术对Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ早熟株、鸡胚株、亲本毒株和Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ早熟     

高温对家蚕蛾粘液腺生长发育及产附性的影响

试验了高温(五龄蚕31℃,蛹期34℃)对家蚕蛾粘液腺生长发育及产附性的影响。结果表明,高温导致粘腺长度缩短、干重减轻、腺体畸形;支部(分泌部)脆质中粗面内质网和线粒体数量减少,形态被破坏。粘液中的蛋白质及其氨基酸组成改变、含量减少是导致粘着力下降及产附性劣化的直接原因。二化性品种比多化性品种更易受高温影响。     

家蚕新突变型微小多星纹的遗传学研究

自家蚕基因库的绿色茧(Gc)系统中发现幼虫斑纹新突变型微小多星纹,其形态特征或在遗传方面与此前报道的ms、msn、Dus和mst均有区别.幼虫在第6~7、9~10环节全部或部分出现过剩星状纹,但此增加的星纹很小,且多不规则,颜色较淡.微小多星纹为多星纹(ms:12—5.5)的等位基因,对ms表现隐性。命名为small multistars,基因符号ms~(?).ms~(?)与ms一样,均与普通斑共存,基因表达也受催青温度影响,但ms~(?)外显率较低.