CRISPR-Cas9基因编辑系统研究进展

由规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein)组成的CRISPR-Cas系统是细菌一种重要的获得性免疫系统。经改造的CRISPR-Cas9系统可在真核生物和原核生物、病毒等基因组内实现目的基因的插入、缺失。尽管由于受到单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)识别序列具有特异性的限制,同时一些物种基因结构存在复杂性和特异性,在基因编辑过程中会出现脱靶现象,在一定程度上限制了CRISPR-Cas9系统更加广泛的应用。但是,CRISPR-Cas9系统已经展现出很强的基因编辑能力,提升科研人员基因编辑的能力,是一项极具有应用潜质的新技术。论文主要阐述了CRISPR-Cas9系统结构、组成、设计策略和应用等方面研究进展,为相关科学的研究提供参考。     

基因编辑益生菌在动物肠道健康上的研究及应用

益生菌是一类有助于动物机体健康的微生物,在提高机体免疫力、改善肠道微生物平衡、促进养殖场环境等方面发挥重要作用。近年来,国内外学者对基因工程技术的探索已逐步深入,并在实际生产中加以应用。但是,目前为止绝大多数的研究将基因编辑技术着眼于真核生物。在此基础上,如何将基因编辑技术应用于益生菌,使益生菌发挥出更大的潜力是当前的研究热潮。因此通过基因工程技术将特定基因与益生菌进行基因编辑并表达,编辑后的益生菌可以表达特定的基因或者靶向对宿主发挥免疫调节作用。作者总结了基因编辑后的益生菌与宿主的相互作用,综述了CRISPR-Cas9技术在基因编辑乳酸菌及畜牧生产上的应用,同时经过分析比较不同基因编辑技术对乳酸菌进行基因编辑的方法,发现CRISPR-Cas9技术是目前针对乳酸菌和双歧杆菌等食品级益生菌相对灵活的基因编辑工具,能够实现益生菌在宿主体内发挥多重健康功效的目的,并对未来CRISPR-Cas9技术在基因编辑乳酸菌中的应用进行了展望,认为未来应将CRISPR-Cas9技术和其他基因编辑方法相结合,探索出更快更高效、简便的益生菌基因编辑技术。     

CRISPR-Cas9系统及其在动物生产和疾病基因治疗中的应用

CRISPR-Cas9系统是生产转基因动物的有力的基因组编辑工具,具有制作相对简单、成本相对较低的优点,可快速用于基因敲除、基因定点突变和基因修复等,在动物基因组定点改造、编辑、疾病控制和治疗中具有广阔的应用前景。文章从CRISPR-Cas9系统的技术原理、研究进展和应用等方面进行描述,旨在阐明CRISPR-Cas9系统的原理及在动物基因组编辑方面的优势和局限,为动物生产、动物基因组编辑、遗传疾病的治疗等研究提供支撑。     

基于CRISPR-Cas系统的病原体检测研究进展

开发快速、灵敏、特异的检测方法对于新发突发人兽共患病、动物疫病的监测及防控至关重要。规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-Cas)系统以高敏感性、特异性及可扩展性的DNA和RNA识别为特点,已成为新一代的分子诊断工具,在病原体快速检测技术研发中得到广泛应用。在新型冠状病毒肺炎疫情中,基于CRISPR-Cas系统开发的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)检测试剂盒(SHERLOCK和DETECTR)在美国相继获批,中国研发的基于CRISPR-Cas12系统的SARS-CoV-2检测试剂盒也已获批上市,这表明基于CRISPR-Cas系统的病原体检测方法在未来的应用前景非常可观。文章首先简述了CRISPR-Cas系统类型,尤其是常用于病原体检测的Cas9、Cas12和Cas13;介绍了CRISPR-Cas系统的作用机理以及广泛应用。同时分析了CRISPR-Cas检测平台研发的关键技术问题,包括靶标基因的序列保守性、靶标基因的富集与扩增、终信号不同的读取方式等,并对CRISPR-Cas系统的未来发展及应用前景进行了展望。     

CRISPR-Cas技术在病毒性传染病诊断中的应用

病毒性传染病尤其是新发和再发病毒性传染病一直是人类和动物健康的重大威胁,而开发准确、快速、便捷的诊断方法有利于病毒性传染病的有效防控。CRISPR-Cas系统是当前应用广泛的基因编辑技术。近年来,有些类型CRISPR-Cas系统已在传染性病原微生物的分子诊断方面展现出巨大潜力,其与核酸扩增、荧光标记等技术结合建立的检测方法准确、灵敏度高、操作简便,不需要很复杂的设备,适宜用于疫病的现场快速诊断。论文综述了CRISPR-Cas系统Ⅱ型CRISPR-Cas9、Ⅴ型CRISPR-Cas12和Ⅵ型CRISPR-Cas13技术的作用机制及其在病毒性传染病诊断中的应用,以期为病毒性传染病的诊断和防控提供参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术及应用研究概述

CRISPR/Cas9是从细菌中发现的一种用Cas9核酸酶对外源DNA进行切割从而保护自身基因完整性的防御机制。通过对其结构中指导性RNA的改变即可便捷地对其识别位点进行改变,在基因编辑的应用方面具有很大潜力。论文主要概述CRISPR/Cas9系统的组成、机制以及优缺点,同时介绍CRISPR/Cas9系统在科学研究、动物疾病治疗以及一些由基因改变导致的疾病模型方面的应用,对CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展进行预测。     

单碱基编辑技术在动物中的应用

近年发展起来的人工核酸酶技术可引起特定位点的DNA双链断裂，断裂后通过同源重组修复机制使精准单碱基编辑成为可能。基于CRISPR/Cas9将Cas9n与胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶融合而开发出的单碱基编辑系统可进一步提高单碱基编辑的效率和精确度，在不造成DNA双链断裂的情况下实现精准单碱基编辑。对动物进行单碱基编辑不仅有望提高其生产性能，而且能为人类疾病研究作出重要贡献。文章回顾了单碱基编辑系统的发展历程，重点介绍了单碱基编辑系统在动物中的应用，并对单碱基编辑系统在动物中的应用前景进行了展望，以期为动物基因编辑技术的研发和应用提供理论依据和应用案例。     

CRISPR-Cas12a在病原检测中的应用进展

发病早期对病原体的快速诊断对疾病的预防和控制具有重要意义。成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPRs）和相关蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）组成的CRISPR-Cas系统是强大的基因编辑工具，其中的CRISPR-Cas12a系统在病原体的快速诊断方面展现出了巨大的潜力，其与核酸扩增、荧光标记等技术结合建立的检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测方便等特点，适合现场即时检测。本文回顾了CRISPR-Cas系统的作用机制，总结了近年来CRISPR-Cas12a在病原菌检测中的研究进展，提出了面临的挑战和展望，以期为病原体检测技术的开发和疫病防控提供参考。     

CRISPR/Cas9系统在猪基因编辑中的研究进展

随着基因编辑技术不断发展,从最初的同源重组到现在的CRISPR系统,基因编辑的操作步骤得到简化,编辑效率得到提高且降低了成本。CRISPR/Cas9系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑,CRISPR/Cas9技术操作简单、定位准确,近年来被广泛使用。本文主要介绍CRISPR/Cas9系统,并对该系统在猪遗传改良、抗病育种、构建人类疾病模型及异种器官移植4个方面的应用研究进行综述。     

猪ZBED6基因有效突变位点的筛选与验证

锌指蛋白ZBED6基因的突变可促进骨骼肌中胰岛素样生长因子2(IGF2)转录水平显著上调,从而促进细胞增殖和肌管形成。本研究利用CRISPR-Cas9技术对猪的ZBED6基因进行编辑,利用在线软件筛选出4个突变靶点,利用p Cas9/g RNA载体构建p Cas9/g RNA-ZBED6质粒,再构建4个用于验证突变效率的p TYNE-ZBED6质粒,同时转染HEK293细胞系,通过观察荧光信号的强弱判断靶序列突变效率的高低。结果表明:位于编码区第17~37位点的靶点1转染后荧光信号最强,切割效率最高,该位点是利用CRISPR-Cas9技术编辑ZBED6基因的有效位点。     

二代靶向测序在CRISPR/Cas9靶区筛选中的应用性研究

旨在利用二代靶向测序技术比较不同靶区对CRISPR/Cas9基因编辑结局的影响,为该技术应用过程中的靶区筛选提供技术参考。本研究进行如下试验:1)以小鼠Pyk2基因为研究对象,针对其第一外显子区设计3个靶区,通过打靶质粒构建、细胞转染及转染细胞DNA二代靶向测序等手段发现,不同靶区总体的基因编辑(Indels)效率相差较大(site1:32.0%;site2:7.9%;site3:69.5%),编辑修复的偏好性也存在较大区别;而对于同一靶区,总编辑效率在2组试验重复中较为稳定(site1:31.8%vs 32.3%;site2:7.4%vs 8.4%;site3:71.3%vs 67.8%),编辑的偏好性也相对一致;2)针对上述筛出的最佳靶区site1,通过sgRNA与Cas9体外转录、小鼠胚胎显微注射和移植及子代的基因型鉴定等手段,结果发现,上述靶区的基因编辑偏好性在基因编辑动物生产中也得到证实;3)利用上述得到的site1靶区插入一个碱基的突变小鼠,在原靶区位置设计与site1仅相差一个碱基的sgRNA。通过突变小鼠基因组PCR和Cas9酶体外切割试验发现,靶区切割位点单碱基的插入就对该靶区编辑的效率产生显著影响(49.2%vs 0%)。综上所述,靶区选择对CRISPR/Cas9基因编辑的结局影响显著,通过二代靶向测序可以有效筛选CRISPR-Cas9基因编辑靶区,并在模式动物生产过程中也获得较好的结果。此外,针对靶区切割位点的单个碱基插入对基因编辑效率影响显著。     

新型基因组编辑技术研究进展

基因组编辑技术是一种能精确靶向修饰生物基因组,实现对基因定点敲除和外源基因定点整合的技术。新出现的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和规律性重复短回文序列簇与Cas9蛋白(CRISPRs/Cas9)系统3种新型的基因组编辑技术通过特异性结构识别靶位点,核酸酶发挥切割作用对靶位点进行定点编辑。3种新型基因编辑技术因具有高效准确、制作简单、耗时短等特点而在生命科学研究中得到广泛应用。论文对目前三种新型的基因组定点编辑技术的特点、结构原理、构建方法以及在传统生物模型、功能基因筛选、人类遗传病基因治疗等方面中的应用做一综述。     

CRISPR/Cas9系统在基因表达调控中的应用

CRISPR/Cas9系统是2012年发展起来由RNA导向的基因组编辑技术。相比ZFN和TALENs技术,CRISPR/Cas9系统具有类似的打靶效率,且更易于操作。通过将核酸酶Cas9蛋白D10A和H840A位点突变,可以获得失去切割活性的dCas9蛋白。借助导向RNA将dCas9与DNA特定位点结合的作用,可以实现抑制或激活基因转录,从而达到对特定基因表达进行调控的目的。本文主要从作用原理、影响因素等方面综述了CRISPR/Cas9系统在基因调控中的应用,以期为相关研究提供参考。     

利用CRISPR-Cas9系统定点突变猪MSTN基因的研究

为了今后能够有效的利用CRISPR-Cas9系统进行基因功能研究及转基因动物的培育,本研究将带有绿色荧光蛋白(GFP)和肌肉生长抑制素基因(Myostatin,MSTN)靶序列的CRISPR-Cas9系统转染入PK15细胞系,利用流式细胞仪分离并收集转染成功的阳性细胞,使用PCR扩增结合克隆测序的方法检测和分析CRISPR-Cas9系统的定点突变情况,以评价CRISPR-Cas9系统的作用效果。结果发现,随机挑选的100个阳性克隆中,38个发生了变异,突变效率为38%,其中32个为插入突变,6个为缺失突变。插入突变中突变1(Mutation1)所占比例最高,为47.4%。本研究中CRISPR-Cas9系统的突变效率达到了38%,是目前进行基因组编辑的一个有效工具,推测其突变类型具有一定的偏好性。     

CRISPR/Cas系统作用机制及其在寄生虫学研究中的应用

CRISPR/Cas系统是一种存在于细菌和古细菌的免疫系统,该系统包括能靶向入侵宿主的病毒或外源DNA核酸片段的RNA和切割该片段的Cas9核酸酶。与其他基因编辑技术相比,该系统更易操作,效率更高,成本更低,被广泛应用于各种基因工程领域。作者综述了CRISPR/Cas系统的作用机制及其在寄生虫方面的应用。     

CRISPR/Cas9技术在猪、鸡中的应用研究进展

基因编辑是利用核酸酶在基因组的特定位点产生DNA双链断裂，从而触发细胞自身的DNA损伤修复机制，实现对靶基因序列进行位点特异性修饰。规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeat，CRISPR）及其相关蛋白9（Cas9）系统作为第3代基因编辑技术在农业和基因治疗研究中发挥着重要作用，与传统的锌指核酶和转录激活因子样效应物核酶基因编辑方法相比，它可以靶向基因的任何位点引起DNA双链断裂，实现目标基因的精准敲除或插入外源片段，并能快速、高效地修饰基因组，包括基因敲除、敲入、抑制、激活等，是应用最广泛的基因编辑工具。CRISPR/Cas9技术的出现彻底改变了生命科学、医学和遗传学研究现状。近年来，利用CRISPR/Cas9技术对动物基因组进行修饰，开启了畜禽分子育种的新纪元，不仅极大地推动了现代畜禽养殖技术的发展，而且为人类医学研究做出了特殊贡献，特别是在猪和鸡上。作者以猪和鸡为对象，综述了CRISPR/Cas9技术在异体器官移植供体、人类疾病的生物模型、抗病育种材料、全基因组高通量筛选等方面的研究进展，以及如何利用CRISPR技术快速又简单地生产出基因编辑猪、鸡，为推动CRISPR技术制备其他基因编辑动物提供参考依据。     

无PAM限制的CRISPR/Cas9系统构建及效率验证

CRISPR/Cas9系统在进行靶向基因敲除、转录激活以及抑制时,需要通过识别Cas9靶位点上的一个原间隔子相邻基序(PAM)序列进行特异性靶向基因编辑。现阶段,被广泛认可的化脓性链球菌SpCas9仅识别比较短的PAM为NGG(N为任意碱基,G为鸟嘌呤)。本实验在野生型SpCas9、PAM为NG的xCas9和SpCas9-NG的基础上,构建预期PAM为NNG的突变体SpCas9NNG、预期PAM为NNN的突变体xCas9NNN和ngCas9NNN,通过双荧光素酶报告基因检测评价其切割活性。结果显示:本次实验构建的ngCas9NNN突变体对PAM为NNN的靶标DNA具有显著的切割活性,为后续拓宽CRISPR/Cas9系统的靶向范围提供重要参考。     

CRISPR/Cpf1双切刻系统的构建与活性检测

Cpf1是2类V型CRISPR-Cas系统的单个RNA引导的核酸内切酶，具有切割DNA的核酸酶活性。该系统由Cpf1核酸酶和CRISPR RNA(crRNA)组成，对于如何提高CRISPR/Cpf1系统的基因编辑效率主要集中在增强crRNA的稳定性、设计对PAM要求更简单的Cpf1变体或者鉴定新型Cpf1核酸内切酶。然而，其是否适用于构建双切刻系统还有待验证。因此，本研究旨在设计3种AsCpf1突变体以及成对的crRNA，进行瞬时转染，利用双荧光素酶报告基因检测评估AsCpf1双切刻系统的编辑效率；同时探究人工改造的crRNA能否提高AsCpf1双切刻系统的编辑效率；以及设计6对具有拓展PAMs序列的crRNA靶向位点，评估HkCpf1双切刻系统在哺乳动物基因组中的编辑效率。结果显示：3种AsCpf1突变体均能不同程度地提高报告基因的相对活性，并具有切割DNA单链的能力。在AsCpf1 crRNA发生突变和延伸后，它们仍然具有引导AsCpf1双切刻系统切割DNA单链的能力。HkCpf1不仅可以用做构建双切刻系统还具有较高的切割活性，并且可以识别5’-YTN和5’-TYYN PAMs序列...