新西兰兔Nrf2基因的克隆、序列分析及组织表达

为分析Nrf2基因在新西兰兔不同组织的表达差异情况,本试验根据GenBank公布的穴兔Nrf2基因序列设计了特异性引物,从兔肝脏中扩增出Nrf2基因并进行了生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR技术研究了Nrf2基因在新西兰兔各组织中的表达差异。结果显示,扩增出的新西兰兔Nrf2基因长度为1 758 bp,编码585个氨基酸。序列比对结果显示,新西兰兔与穴兔、人、牛、鼠、斑马鱼等各种属动物Nrf2基因的核苷酸一致性为50.70%～99.83%。进化树分析表明Nrf2在物种间具有较高的保守性。实时荧光定量PCR结果显示,Nrf2基因在新西兰兔的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑中均有表达,且肾脏中表达量最高,脾脏中表达量最低。本试验克隆了新西兰兔Nrf2基因,并研究了其mRNA在兔各组织中的表达情况,为开展兔Nrf2/ARE信号通路的研究奠定了基础。     

水牛Keap1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875 bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。     

鹅GHR基因荧光定量PCR险测方法的建立

采用PCR方法克隆了鹅生长激素受体(GHR)基因,构建了重组质粒pMD-18T-GHR,并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-18T-GHR为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测GHR的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法构建的标准曲线线性关系良好,建立的GHR基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可以检测出低于10个拷贝/μL的样品),准确可靠.籽鹅和莱茵鹅GHRmRNA出壳到90日龄生长过程中肝脏中的表达量不同,30日龄不同组织表达量各有变化特点.     

鸡Caspase-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。     

鹅GHR基因荧光定量PC凡检测方法的建立

采用PCR方法克隆了鹅生长激素受体（GHR）基因,构建了重组质粒pMD-18T-GHR,并将其作为标准阳性模板。通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-18T-GHR为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测GHR的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法构建的标准曲线线性关系良好,建立的GHR基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强（可以检测出低于10个拷贝／μL的样品）,准确可靠。籽鹅和莱茵鹅GHRmRNA出壳到90日龄生长过程中肝脏中的表达量不同,30日龄不同组织表达量各有变化特点。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p27基因绝对定量PCR方法的建立及应用

研究旨在建立一种检测禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p27(ALV-p27)基因实时荧光定量PCR的方法。通过设计ALV-p27特异性的荧光定量PCR引物扩增基因并制备质粒标准品,同时建立检测病毒衣壳蛋白p27基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法检测6日龄胚胎感染,1日龄出壳雏鸡不同组织中p27基因的分布和表达情况。结果表明,ALV-p27基因在1日龄雏鸡脑组织中表达水平最高,而在胸腺组织中表达水平最低。研究建立的检测ALV-p27基因绝对定量PCR方法为进一步研究其生物学功能提供了一种技术手段。     

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NLRP3。以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。通过反应条件优化,成功建立了检测NLRP3基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示,所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因,建立的实时荧光定量PCR对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好,标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系。与对照组相比,NLRP3分子在FAdV-4感染鸡肝和脾中的转录水平极显著高于对照组(P0.001),在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组(P0.01)。本研究所建立的鸡NLRP3基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可以检测FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3的转录水平;致病性FAdV-4感染所造成的组织炎症损伤与NLRP3分子密切相关。     

陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1(G protein-coupled receptor 1,GPR1)基因真核表达载体,并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后,使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFPN1-GPR1进行鉴定,并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA,实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况;提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA,实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明,陆川猪GPR1基因CDS全长1 068bp,成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体,重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光,且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实,GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组(P0.01)。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高,在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达,在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1,并获得了GPR1基因组织表达谱,为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。     

陆川猪GPR1基因真核表达载体构建及组织表达谱分析

试验旨在构建陆川猪G蛋白偶联受体1（G protein-coupled receptor 1，GPR1）基因真核表达载体，并对其组织表达谱进行分析。采用RT-PCR技术从10周龄陆川猪皮下脂肪组织中扩增出GPR1基因CDS区后，使用常规分子克隆手段构建含GPR1基因片段的真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-N1-GPR1进行鉴定，并以脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。收集所转染3T3-L1细胞并提取其总RNA，实时荧光定量PCR进一步检测GPR1真核表达载体表达情况；提取6头10周龄陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪总RNA，实时荧光定量PCR检测GPR1基因mRNA在陆川猪各组织中的表达量。结果表明，陆川猪GPR1基因CDS全长1 068 bp，成功将其连接至pEGFP-N1真核表达载体，重组表达载体pEGFP-N1-GPR1质粒和空载pEGFP-N1质粒所转染3T3-L1细胞均能表现出绿色荧光，且空白对照组并未表现出绿色荧光。实时荧光定量PCR结果证实，GPR1基因在重组质粒试验组的表达量极显著高于空载质粒组（P<0.01）。GPR1基因在10周龄陆川猪肝脏中表达量最高，在心脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪中均有表达，在背最长肌中几乎不表达。本试验成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-GPR1，并获得了GPR1基因组织表达谱，为进一步研究GPR1基因对陆川猪脂肪沉积的影响提供参考。     

鸡宿主限制因子SAMHD1实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测chSAMHD1表达量的方法,本研究以SPF鸡外周血单个核细胞总cDNA为模板,构建了包含chSAMHD1全长CDS的重组质粒pMD-chSAMHD1。跨chSAMHD1内含子设计1对荧光定量PCR特异性引物,以构建的重组质粒作为标准品,建立chSAMHD1实时荧光定量PCR检测方法,并对其敏感性、特异性及重复性进行验证,将其应用于1日龄SPF鸡组织chSAMHD1表达量的检测。结果显示:用建立的实时荧光定量PCR方法对5×10^8~5×10^4拷贝/μL的标准质粒进行检测,所得标准曲线呈现良好的线性关系;最低检测限为50拷贝/μL,灵敏度是普通PCR的100倍;特异性良好,仅能检测到鸡源细胞中SAMHD1基因;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%;应用该方法检测1日龄正常SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、神经、胸腺、法氏囊、十二指肠、腿肌、腺胃等组织的chSAMHD1基因拷贝数,结果显示chSAMHD1具有广泛的组织分布性。本研究为chSAMHD1功能研究提供了一种准确、有效的检测手段。     

雏鸡肠组织β1基因的鉴定及时空表达特性

设计1对引物,建立RT-PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定1²0日龄雏鸡不同肠段组织β1基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致(扩增曲线斜率差<0.1),满足使用比较Ct值法对β1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。     

鸽白细胞介素8基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸽白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）基因实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上公布的鸽IL-8基因序列,在保守区域设计1对特异性引物,以鸽子淋巴细胞提取的核酸为模板扩增鸽IL-8基因部分片段并克隆到pMD18-T载体上。提取重组质粒通过系列制备标准品,建立鸽IL-8基因SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,实时荧光定量PCR熔解曲线呈单一熔解峰,试验线性相关系数为1.0,IL-8基因的扩增效率为103%。敏感性结果显示最低可检测到16个拷贝数;用该方法检测其他鸽白细胞介素细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18）和双蒸水的结果均为阴性。批间、批内变异系数均≤1.52%。因此,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于鸽IL-8 mRNA的检测,为病毒感染宿主细胞后细胞因子表达的定量分析奠定基础。     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

家禽beta-连环蛋白基因绝对定量PCR方法的建立及应用

根据GenBank中公布的原鸡beta-连环蛋白(β-catenin)参考序列设计特异性引物扩增得到β-catenin基因,并克隆到真核表达载体pcDNA3.1中作为荧光定量PCR标准品;同时利用软件设计家禽β-catenin的荧光定量PCR引物,建立检测β-catenin的绝对荧光定量PCR方法。并利用该方法检测病毒感染组与非感染组1日龄雏鸡不同组织中β-catenin基因的分布和表达情况。结果显示,在感染和非感染病毒的1日龄雏鸡中,β-catenin基因在脑组织中表达水平最高,而在脾脏和法氏囊中表达水平较低。结果表明,成功建立了检测家禽β-catenin基因的绝对定量PCR方法,并检测了β-catenin基因在1日龄雏鸡不同脏器中的表达情况,为进一步研究其生物学功能提供了技术手段。     

雏鸡肠组织β1基因的鉴定及时空表达特性

设计1对引物,建立RT—PCR方法对β1基因mRNA进行鉴定;以GAPDH基因为内参,建立检测鸡β1基因表达水平的sYBRGreenI实时荧光定量PCR方法,并用此方法测定1～20日龄雏鸡不同肠段组织81基因表达水平。结果显示,从鸡肠组织成功鉴定出β1基因mRNA;检测内参基因GAPDH和目的基因β1的实时荧光定量PCR方法扩增效率一致（扩增曲线斜率差〈0．1）,满足使用比较Ct值法对B1基因mRNA进行相对定量分析的前提;扩增曲线、熔解曲线及凝胶电泳结果提示该方法特异性好。实时荧光定量PCR检测结果表明,1日龄雏鸡十二指肠和盲肠、10日龄雏鸡空肠和直肠、5日龄雏鸡回肠组织中β1基因相对表达量最高。结果表明,鸡肠组织中存在β1基因表达,并在不同日龄不同肠段表达水平存在差异。     

鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立鸭白细胞介素-1β(IL-1β)基因的实时荧光定量PCR检测方法,并检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平,试验根据GenBank上鸭IL-1β基因序列设计特异性引物,以鸭IL-1β基因克隆质粒为模板,SYBR GreenⅠ为荧光染料,建立鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法,并用该方法检测鸭机体器官/组织中IL-1β基因的转录水平。结果表明:建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR方法的熔解曲线为特异性单峰,标准曲线方程为y=-3. 329x+39. 731,扩增效率为99. 7%,相关系数为1,批内重复变异系数小于1. 00%,批间重复变异系数小于2. 00%;实时荧光定量PCR方法的检测敏感性是普通PCR方法检测敏感性的1 000倍;以该方法进行检测发现,鸭的法氏囊、肺脏、肝脏、肌肉、脑、脾脏、肾脏、十二指肠、心脏和胸腺中IL-1β基因mRNA含量分别为428. 45,973. 43,1 394. 19,568. 22,551. 54,839. 91,2 586. 22,1 161. 92,459. 17,3 276. 16 copies/μL,其中胸腺中含量最高,而法氏囊中含量最低。说明试验建立的鸭IL-1β基因实时荧光定量PCR检测方法具有重复性好和敏感性高等特点,可用于鸭机体器官/组织中IL-1β基因转录水平的检测分析。     

荧光定量PCR检测牛性别相关基因DAX1表达的标准质粒和标准曲线的构建

本研究根据GenBank中登录的剂量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良基因1(dosage-sensitive sex reversal,adrenal hypoplasia critical region,on chromosome X,gene 1,DAX1)设计引物,构建包含DAX1基因cDNA片段的质粒,作为中国荷斯坦牛DAX1基因mRNA定量检测的标准品,建立了DAX1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法.结果表明,该方法特异性好,检测灵敏度达102拷贝,线性范围为102～106拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值间有着良好的线性关系(r=0.99975),扩增效率高(E=100%),可以作为检测牛DAX1基因mRNA定量检测方法.     

实时荧光定量PCR检测鸡生长激素基因方法的建立

本研究旨在建立定量分析鸡生长激素(Growth hormone,GH)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为鸡GH基因mRNA表达水平的定量分析及探讨其与马立克氏病遗传抗性间关系奠定基础。根据GenBank数据库中鸡的GH基因序列,使用Oligo7软件在该基因保守区域设计合成一对引物并扩增GH基因片段,经回收纯化后连接到pGM-T载体,成功构建了含有GH基因片段的pGM-T-GH标准质粒。在此基础上,通过SYBR GreenⅠ染料法建立了pGM-T-GH重组质粒的实时荧光定量PCR标准曲线及其回归方程,成功建立了实时荧光定量PCR检测鸡GH基因的方法。     

鉴别RHDV与RHDV2荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的鉴别检测兔出血症病毒(RHDV)与兔出血症病毒2型(RHDV2)荧光定量RT-PCR检测方法,本研究选择RHDV与RHDV2 VP60基因序列高度同源的保守区域设计了3对引物,经荧光定量PCR扩增比较,筛选出1对引物,对各反应条件进行优化,建立了RHDV与RHDV2荧光定量PCR检测方法,且基于RHDV较RHDV2扩增产物熔解曲线Tm值高1.57℃～2.74℃,能够达到鉴别检测的目的。特异性试验显示,该方法仅对RHDV和RHDV2检测为阳性,对猪瘟兔化弱毒、兔多杀性巴氏杆菌、A型魏氏梭菌、波氏杆菌检测均为阴性,特异性强。敏感性试验显示,该方法对RHDV与RHDV2 VP60基因重组质粒标准品的最低检测限均为1×10~1拷贝/μL,敏感性高;重复性试验显示,RHDV VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.91、3.60,Tm值最大变异系数分别小于0.72、0.48;RHDV2 VP60基因质粒标准品批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.90、3.93,Tm值最大变异系数分别为0.29、0.17,均小于5%,重复性好。采集RHDV AV34株感染病死兔的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心肌组织、内皮组织、口鼻粘液、肌肉组织、肛门排泄物、尿液等组织样品,进行病毒组织分布与排毒的检测,结果显示,各组织样品均为阳性,表明病毒在体内分布广泛,病毒可通过口鼻分泌物及粪尿排泄物排出。利用该方法检测临床肝组织样品,结果显示,RHDV AV34标准株阳性肝组织与14份RHDV临床肝组织样品、RHDV2分离株SC2020/04感染样品均为阳性,而常规RT-PCR方法对其中1份RHDV临床肝组织样品检测为阴性,两种方法符合率为93.3%。本研究建立了一种能够鉴别检测RHDV与RHDV2的荧光定量RT-PCR方法,为开展兔病毒性出血症的临床诊断、流行病学调查与防控等提供了有效的技术保障。     

荧光定量PCR检测小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达

目的:应用SYBR G reen I染料法建立检测Mad2 mRNA表达的实时荧光定量PCR的方法,并探讨小鼠卵母细胞减数分裂成熟中Mad2 mRNA的表达。方法:采用实时荧光定量PCR的方法,以SYBR G reen I为荧光染料,梯度稀释的重组质粒为模板制作标准曲线,并以此方法分析了小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达的动态变化。结果:建立了实时荧光定量检测方法分析小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达,该方法灵敏、特异,扩增效率接近100%。进行了标准曲线的制作,以及对目的基因Mad2转录水平的绝对定量。结论:实时荧光定量PCR是检测基因表达水平的理想选择,在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达存在动态变化。