滨麦HMW GS启动子和编码区基因的分离与序列分析

为了深入了解滨麦（Leymus mollis）HMWGS基因的结构特征,采用PCR方法,从滨麦基因组中分离出HMWGS基因启动子序列（Genbank登录号：FJ600498）和编码区序列（Genbank登录号：GQ169797）。启动子序列（FJ600498）从5′至3′方向依次有Ebox、Nbox、Gbox、HMW谷蛋白特异增强子和TATAbox等麦谷蛋白特异调控元件,推断其为滨麦HMWGS启动子基因。编码区序列（GQ169797）具有单一完整的开放阅读框（ORF）,编码396个氨基酸残基,依次包含信号肽、N末端区、中部重复区和C末端区等HMWGS的典型结构区域;中部重复区主要重复单元为6肽（PQQGQQ）和9肽（GYYPTSPQQ）;有6个半胱氨酸残基（Cys）,分布在N末端区（5个）和C末端区（1个）,第3、4个相邻。推断其为滨麦的y型HMWGS编码区基因。系统进化分析表明,启动子序列（FJ600498）与异形花草（He. piliferum）和冰草（Ag. cristatum）的HMWGS启动子基因序列具有相对较近的同源关系;编码区序列（GQ169797）与纤毛鹅观草（Elymus ciliaris）和披碱草（E. glaucus）的HMWGS编码区基因序列具有相对较近的同源关系。     

GmAGL15基因启动子的克隆及序列分析

为探明大豆CanAGL15基因的表达调控规律,应用电子克隆技术从大豆基因组中克隆了CanAGL15 1000 bp的启动子序列,用PLACE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的一般结构,如TATA-BOX、CAAT-BOX.另外还含有一些顺式作用元件,如调控GmAGL15的组织特异的和特定发育阶段的表达,对胁迫的应答,对光的响应,以及反馈调节,推测大豆GmAGL15基因表达有相应组织特异性,可能受蔗糖、生长素和乙烯等的调控.用FootPrinter和PLACE在线工具对大豆与拟南芥等其他4种植物的同源基因启动子的顺式元件进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了CanAGL15基因表达调控的精确性或多样性.     

滨麦蔗糖:果聚糖6-果糖基转移酶(6-SFT)基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

为了挖掘和利用滨麦(Leymus mollis,2n=4x=28,JJNN)的优良基因,以拓宽小麦非生物胁迫抗性基因资源,以滨麦为材料,利用RT-PCR结合RACE技术从滨麦叶片中克隆到6-SFT基因cDNA的全长序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,其cDNA全长为2 086bp,开放阅读框为1 866bp(命名为Lm-6-SFT),编码621个氨基酸;其推导的蛋白分子量为69.1kDa,理论等电点(pI)为5.18,属于酸性蛋白。保守结构域分析表明,该基因推导的氨基酸序列含有SDPDG、RDP和EC结构域。多序列比对及进化树分析表明,滨麦6-SFT与冰草6-SFT在氨基酸水平具有高度的序列相似性。     

豫麦50低分子量麦谷蛋白亚基基因的克隆与序列分析

为揭示Glu-D3位点编码的低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）基因的分子特征,并开发能有效地应于育种选择的分子标记,根据已注册的D基因组来源的LMW-GS基因编码区的保守区域,设计1对特异性简并引物,采用基因组PCR法,从豫麦50中克隆出LMW-GS基因后进行序列分析。结果表明,本研究共得到了6个具有独特编码区的核苷酸序列(命名为LMW-Y50-1~LMW-Y50-6;GenBank注册号为JN831414~JN831417、HM055908和JX828375)。其中,4个（LMW-Y50-2,LMW-Y50-4~LMW-Y50-6）具有完整的开放阅读框。推导的氨基酸序列比对分析表明,这4个基因均具有LMW-m型LMW-GS的典型分子特征,其中,LMW-Y50-5缺失N-末端第1个保守的半胱氨酸残基,LMW-Y50-6在C-末端I区含有1个额外的半胱氨酸残基,LMW-Y50-2和LMW-Y50-4均含有8个保守的半胱氨酸残基。根据N-末端和C-末端保守序列,4个基因均属于定位在1D染色体上的IV型7、8和10组基因。所得基因序列与36个代表不同位点、不同等位变异或不同单倍型LMW-GS基因序列的聚类分析表明,4个基因分别与D3-2、D3-4和D3-6单倍型有更高的同源性。表明本研究设计的简并引物可对D基因组来源的m-型LMW-GS基因进行特异扩增。而考虑到半胱氨酸残基数目和位置对面筋品质的重要影响,推测含有异常半胱氨酸残基数目的LMW-Y50-3和LMW-Y50-4基因,尤其是LMW-Y50-3基因,可能与豫麦50优质弱筋的面筋品质有关。     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的启动子的克隆与序列分析

MeLTI6A（Manihot esculenta low temperature inducible 6A）是木薯低温干旱诱导基因,本研究从MeLTI6A 的序列出发,利用电子克隆设计引物进行PCR扩增的方法获得该基因的启动子,其序列共1 304 bp。生物信息学分析发现该启动子中具有真核生物典型的核心启动子区（TATA-box和CAAT-box）,并利用α-互补,蓝白斑筛选原理验证了该启动子核心序列具有活性;该启动子具有与干旱胁迫相关的激素类（如脱落酸、乙烯）的响应元件和逆境胁迫（如低温、干旱胁迫）的响应元件;还具有与木薯组织特异表达相关的调控元件和其它光响应元件;并通过Real time PCR检测了低温胁迫（4 ℃）下的木薯组培苗中MeLTI6A的表达变化,说明了该启动子区的低温胁迫顺式作用响应元件可能调节MeLIT6A在低温胁迫下的表达。这些说明木薯的MeLIT6A基因可能是通过对干旱胁迫激素信号响应以及逆境胁迫响应起作用,使木薯获得一定的抗胁迫的能力,同时还可能参与了木薯相关组织发育过程的调控。本研究有利于对MeLTI6A基因抗逆境胁迫功能的理解,为探索木薯高效抗逆的分子机制作初步研究。     

陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的启动子序列分析

为了筛选棉花耐盐转基因育种所需的诱导型候选启动子,本研究根据陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的cDNA序列和陆地棉基因组序列,获得陆地棉焦磷酸酶基因GhVP启动子序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该启动子具有多个基本元件TATA-box和CAAT-box,并含有多种逆境胁迫诱导相关的响应元件,含有丰富的光响应元件以及其他多种顺式作用元件。推测GhVP基因的转录同时受光、高温、干旱、创伤、脱落酸诱导,受生物钟控制的顺式元件调控,参与棉花的生长发育。     

陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列分析

为了筛选棉花抗逆转基因育种的候选启动子,根据陆地棉脱水素基因GhDHN1的cDNA序列和陆地棉基因组序列,利用生物信息学分析方法,获得棉花陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列。结果表明,该启动子上多个位点含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,并含有非生物逆境胁迫响应元件、响应植物激素顺式作用元件、多种光调控相关的顺式作用元件以及胚乳表达顺式调控元件等。推测GhDHN1基因的启动子受光诱导,同时受低温和干旱胁迫等非生物逆境的诱导,参与棉花的生长发育。     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。     

草菇gpd启动子的克隆及序列分析

根据已报道的gpd启动子的序列设计合成了一对引物,以草菇菌丝的基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法克隆出一条长1367bp的DNA特异片段gpd-vv。gpd-vv序列用Promoter Scan Ⅱ和Promoter Predictions软件进行分析,结果表明,其序列上有6个核心启动子区,而且除了具有一般启动子的CAAT-box、TATA-box等基本顺式作用元件外,还含有几个重要的元件如G-box,GC-motif,CTrich-motif等。经Tfsitescan Service分析,gpd-vv序列还包含多个转录因子的结合位点,包括GCR1,GCN4,AFT1,Repressor of CAR1等。      

玉米ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子的克隆与序列分析

根据已知玉米全基因组序列设计引物,采用PCR方法从基因组DNA中克隆两种玉米材料的Zm-NAS1和ZmNAS2基因启动子,利用生物信息学软件对启动子元件进行分析预测并比较在两种材料间差异。结果表明,ZmNAS1基因启动子在两种材料上差异明显,沈137较K12除一段574bp缺失外,他们之间还有24处单核苷酸多态性位点;两种材料间的ZmNAS2基因启动子无差异。ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子均具有一些与光调控、激素诱导、响应逆境胁迫等有关的顺式作用元件,但数目存在一定差异;两个基因启动子上都有一定数目缺铁诱导元件的核心序列。根据启动子元件分析,初步判断ZmNAS1和ZmNAS2基因除受缺铁诱导表达外,还可能受到其他多种信号的共同调控,是一个复杂的调控过程。此外,ZmNAS1基因启动子在两种材料间差异明显,推测该基因在两种材料间受到的表达调控水平也不相同。     

大豆GmGAMYB1启动子克隆与分析

利用PCR技术从大豆品种东农42基因组中分离得到了GmGAMYB1基因启动子片段pGmGAMYB1,定向替换载体pBI121的CAMV35S组成型启动子,构建表达载体pBI121-pGmGAMYB1,驱动下游报告基因GUS基因表达,并利用PLACE和PlantCARE在线启动子预测工具进行分析.结果表明:序列中含有多种典型的光及各种激素和胁迫诱导特异性表达元件,如光应答元件如3-AF1 binding site、BOX-4、T-Box和TCT-motif;赤霉素应答元件GARE;脱落酸应答元件ABRE;热激元件CCAATBox;节律钟Ciradian等.     

油菜叶片衰老相关基因的分离：ATP硫化酶cDNA的克隆和序列分析

通过筛选缩减ｃＤＮＡ文库中在油菜叶片衰老阶段表达而在绿叶中不表达的ｃＤＮＡ克隆,分离了与油菜叶片衰老有关的基因ＬＳＣ６６。ＤＮＡ序列测定和分析结果表明,ＬＳＣ６６的全长可读框架由１３８０个碱基组成,编码４６０个氨基酸,它的核昔酸序列与拟南芥菜ＡＴＰ硫化酶基因有８６．６７％的同源性,其推导的氨基酸序列与拟南芥菜ＡＴＰ硫化酶的氨基酸序列有９１．７４％的同源性。对ＬＳＣ６６基因产物在植物叶片衰老过程中的作用进行了讨论。     

水稻蛋白激酶基因启动子OsSRLp的分离及特性分析

【目的】为研究水稻中I型酪蛋白激酶基因OsSRL启动子的结构及功能,【方法】以水稻中花11基因组DNA为模板,经PCR扩增获得基因上游约1600 bp序列,命名为启动子OsSRLp。应用PLACE在线软件,分析序列中的顺式作用元件,同时构建含有GUS报告基因的植物表达载体,转化水稻。【结果】OsSRL为组成型表达,OsSRLp含有调控生殖发育、激素应答及逆境响应等多种顺式作用元件。OsSRLp驱动的GUS报告基因在根、茎中均有所表达,在小穗中表达丰度较高,而在其他组织中表达丰度较低。【结论】OsSRLp为组成型启动子,其下游调控基因OsSRL可能参与水稻发育及生殖过程。     

华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)LMW-GS基因的克隆和序列分析

为了挖掘和利用华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)的优良基因,应用PCR技术对华山新麦草低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因进行了分子克隆和序列分析.结果表明,华山新麦草LMW-GS基因( HS-LMW-1)长度为866 bp,通过提交NCBI进行同源性比较, HS-LMW-1与小麦属LMW-GS基因序列的同源性在83％以上,其中与Thinopyrum intermedium的LMW-GS基因序列(GenBank登录号:AY214454)相似性达92%,进一步将其翻译为氨基酸序列,分析结果显示它具有小麦属LMW-GS序列的典型特征,具有完整的编码区,能够编码274个氨基酸的成熟蛋白,与小麦属Glu-B3和Glu-D3位点编码的LMW-GS基因有很高的一致性,表明 HS-LMW-1基因可能由华山新麦草的Glu-Ns3位点编码.     

Isolation and Analysis of the Cppsy Gene and Promoter from Chlorella protothecoides CS-41

Phytoene synthase (PSY) catalyzes the condensation of two molecules of geranylgeranyl pyrophosphate to form phytoene, the first colorless carotene in the carotenoid biosynthesis pathway. So it is regarded as the crucial enzyme for carotenoid production, and has unsurprisingly been involved in genetic engineering studies of carotenoid production. In this study, the psy gene from Chlorella protothecoides CS-41, designated Cppsy, was cloned using rapid amplification of cDNA ends. The full-length DNA was 2488 bp, and the corresponding cDNA was 1143 bp, which encoded 380 amino acids. Computational analysis suggested that this protein belongs to the Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily. It contained the consensus sequence, including three predicted substrate-Mg²⁺ binding sites. The Cppsy gene promoter was also cloned and characterized. Analysis revealed several candidate motifs for the promoter, which exhibited light- and methyl jasmonate (MeJA)-responsive characteristics, as well as some typical domains universally discovered in promoter sequences, such as the TATA-box and CAAT-box. Light- and MeJA treatment showed that the Cppsy expression level was significantly enhanced by light and MeJA. These results provide a basis for genetically modifying the carotenoid biosynthesis pathway in C. protothecoides.