美国松材线虫体表携带优势细菌的鉴定及致病性

为证实松材线虫Bursaphelenchus xylophilus虫株携带弱毒细菌替代强毒株系防治松树萎蔫病这一思路的可行性,从2个美国松材线虫虫株体表分离并确定了优势细菌,测定了各优势细菌的毒性和致病性．并对这些菌株进行了初步鉴定。细菌分离结果显示：MG4,MG5,MG8和MG9等4菌株为美国线虫体表的优势菌株。毒力测试表明．与中国松材线虫携带的强致病菌相比,美国松材线虫携带的4个菌株的产毒能力和致病性均较低．可以作为生防细菌的候选菌株使用。经细菌的常规染色、形态学观察及16SrDNA序列分析,MG4,MG5,MG8和MG9菌株分别被鉴定为代夫特茵Deftia tsuruhatensis,恶臭假单胞茵Pseudoinonas putida,嗜麦芽窄食单胞茵Stenotrophomonas maltophilia和泛菌属1种Pantoea sp．。图2表3参20     

中国日本松材线虫虫株对不同松苗的致病性及在树体内移动特点比较

为了解不同松材线虫虫株在致病性方面的差异,选用分离自日本和中国浙江的松材线虫虫株,分别接种雪松、黑松和马尾松,比较其感病情况,并在不同时期分离树体内的线虫,比较不同虫株在不同寄主体内的移动和分布情况.结果表明,2个日本虫株和1个中国虫株都能使黑松和马尾松感病和枯死,3虫株对黑松和马尾松的致病力没有明显差异;日本松材线虫虫株能使雪松枯死,枯死率在50%左右;中国松材线虫虫株不能使雪松致病,但在其体内可以分离到松材线虫.不同时期分离各寄主体内线虫发现.接种72 h前线虫数量处于调整期,接种144 h后线虫数量开始上升或下降.日本虫株接种雪松后,线虫数量呈递增趋势:中国虫株接种雪松.线虫数量在接种144h后开始下降.我国雪松不感染松材线虫病是由于线虫虫株发生了变异.     

松材线虫携带的一株细菌分离及其致病性

从患松材线虫病致死的黑松和马尾松病树组织及松褐天牛虫体中分离的松材线虫虫体上均分离到同一细菌菌株 .经致病性、革兰氏染色、菌体形态、培养性状和生理生化反应等测定 ,将致病菌株鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌 .ATBExpression自动鉴定仪的鉴定结果与上述结果相同 .在分离过程中该菌出现频率较高 ,说明是松材线虫携带的主要细菌 .人工接种试验结果显示 ,用无菌线虫或洋葱伯克霍尔德氏菌菌株分别接种的黑松无菌苗不发病 ,而用二者混合接种则使无菌苗迅速发生褐变和萎蔫 .林间利用 6年生黑松进行的接种试验结果证明 ,用无菌松材线虫和洋葱伯克霍尔德氏菌菌株混合接种的黑松与使用野生松材线虫接种的黑松都 10 0 %的患病 .单独用无菌松材线虫接种有 4株发病 ,6株没有发病 .其中发病黑松中不仅分离到了松材线虫 ,也分离到了细菌 ,而没有患病的 6株黑松中仅分离到少量松材线虫 .这说明在野外条件下接种的松材线虫可以通过某种途径重新获得细菌 ,导致了接种的黑松患病 .而接种后无菌松材线虫没能获得细菌的那些黑松就没有患病 ,说明单独无菌松材线虫不能使黑松患病 .这些结果说明松材线虫携带的细菌与松材线虫的致病性有关 .因此 ,可以把松材线虫病看作是线虫和细菌共同侵染引起的一种植物复合侵染病害 .在这     

奶牛场蚊蝇体内细菌种类的调查

为了解奶牛场环境中蚊蝇体内携带细菌的情况,从贵阳市 4个规模化奶牛场采集蚊子和苍蝇各34只进行细菌的分离与鉴定.结果表明:从21只蚊子和33只苍蝇体内分离到细菌,检出率分别为 61.76%和97.1%;在分离的53株细菌中,鉴定为大肠埃希氏菌的有5株、克雷伯氏菌3株、志贺氏菌4株、肠杆菌1株、表皮葡萄球菌6株、腐生葡萄球菌2株和未定种32株.结果可为奶牛场细菌性疾病的综合防治提供科学数据.     

松树上几种线虫携带细菌的种类与毒性

从不同地区不同松树上采集分离不同种类的线虫,对线虫携带的细菌进行分离鉴定,并用黑松无菌苗及愈伤组织测定细菌的毒性.细菌分离结果表明:松材线虫携带的优势菌为荧光假单胞菌,与其他线虫携带的细菌种类不同.毒性测定结果显示:松材线虫携带的优势菌株毒性最强,拟松材线虫及滑刃属线虫携带的细菌具有一定程度的毒性,小杆线虫携带的细菌没有任何毒性.结果进一步证明了松材线虫携带的细菌在其致病过程中发挥着重要作用.     

应用细胞培养方法分离猪源弓形虫虫株

为获得猪源弓形虫野生虫株,对细胞培养过程中的培养基种类、血清用量及培养佐剂等条件进行优化,选择最佳分离条件。对临床血清学检测呈阳性猪场的19份血液样品进行弓形虫虫株的培养检测,共获得野生虫株10株。运用PCR方法进行初步鉴定,证实分离虫株为弓形虫野生虫株。结果表明,细胞培养方法是一种分离弓形虫虫株较为理想的方法。     

南亚实蝇成虫肠道细菌的分离与鉴定

采用传统的微生物培养和16S r DNA(V6-V8)高变区测序相结合的方法,从室内人工饲养的性成熟南亚实蝇雌虫肠道中分离、鉴定出21株细菌,均属于γ-变形菌门,分别为肠杆菌属(7株)、拉乌尔菌属(3株)、沙雷氏菌属(2株)、普罗维登斯菌属(2株)、不动杆菌属(1株)、柠檬酸杆菌属(1株)、西地西菌属(1株)和不可培养的细菌(4株);从性成熟的南亚实蝇雄虫肠道内分离得到20株细菌,分别为细菌(7株)、克雷伯氏菌属(4株)、肠杆菌属(3株)、普罗维登斯菌属(2株)、沙雷氏菌属(1株)、摩根菌属(1株)、假单胞菌属(1株)和γ-变形杆菌(1株),也均属于γ-变形菌门.由上可知,性成熟的南亚实蝇雌、雄成虫肠道共有细菌为肠杆菌属、普罗维登斯菌属和沙雷氏菌属,均属于肠杆菌科,表明肠杆菌科是南亚雌、雄成虫肠道细菌的优势菌群.     

水葫芦内生细菌的分离与鉴定

采用20种不同培养基分离水葫芦内生细菌,利用细菌脂肪酸鉴定技术对水葫芦的内生细菌进行鉴定,研究了水葫芦内生细菌的种类及群落结构.结果表明,共得到32个属56株内生细菌,种类最多的是微杆菌属(Microbacterium),共有9种细菌.其次为假单胞菌属(Pseudomorms),共有7种细菌.芽孢杆菌属(Bacillus)有 5种细菌.其余23个属均有1种.利用优势度指数分析各培养基分离到内生细菌的多样性,10号葡萄糖、酵母、淀粉琼脂培养基优势度指数为0.160 7,分离得到内生细菌种类最多为9种;其次是4号根瘤菌培养基和11号NA培养基的优势度指数为0.125 0,分离得到的内生菌种类均为7种;16号黄豆芽汁培养基(pH7.2～7.4)和20号醋酸菌培养基,优势度指数为0.089 3,分离获得内生细菌均为5种.     

药用植物青阳参可培养内生菌分离与多样性分析

[目的]从云南民间药用植物青阳参的根、茎和叶中分离内生菌,并且进行初步分类鉴定,对分离出的内生菌多样性进行分析.[方法]利用平板分离法分离内生细菌和真菌,通过菌落形态、革兰染色形态观察和生理生化特征鉴定细菌,根据显微形态观察分类鉴定真菌.[结果]从植物根、茎和叶中共分离获得56株内生菌,包括22株细菌和34株内生真菌.22株内生细菌经鉴定归属于6个属,25株真菌经鉴定归属为5目7科12个属.[结论]青阳参植物内生菌存在多样性.不同部位内生菌的数量、组成与种群分布存有差异.该研究为青阳参资源的开发利用提供了理论依据.     

细菌对松材线虫繁殖的影响

该研究采用从中国松材线虫病发生的6个疫区、2种主要寄主马尾松和黑松的不同发病期采集病木,从病木上直接分离并鉴定了松材线虫携带的18株属于假单胞属、泛菌属以及其他属的细菌菌株.用双氧水处理松材线虫卵得到无菌卵,在无菌条件下,研究松材线虫携带的细菌对其繁殖的影响.结果表明只有假单胞菌属的细菌菌株能够显著促进松材线虫的繁殖,其他细菌菌株均抑制松材线虫的繁殖.该试验证明了假单胞菌属的细菌在松材线虫病发病过程中起重要的作用,这一发现为松材线虫病的线虫与细菌复合致病假说提供了进一步的实验证据.      

草甘膦抗性菌株的分离鉴定及其抗性基因的克隆

从草甘膦污染土壤中分离获得一株耐受400 mmol/L草甘膦的菌株S1536,该菌株在草甘膦浓度为100～400 mmol/L之间生长迅速,最适pH为6.0,最适生长温度为30℃,具有氨苄青霉素抗性。以S1536基因组DNA为模板,通过通用引物进行扩增、测序获得其16S rDNA序列,在GenBank登录号为MG519831,在NCBI中经BLAST比对与泛菌属（Pantoea sp.）同源性达到99%。用ClustalW对S1536与泛菌属各个种模式菌的 16S rDNA进行多重序列对比,该菌株与Pantoea rodasii同源性最为接近,达到99.2%,故将菌株S1536命名为Pantoea rodasii S1536。该菌株具有较高草甘膦抗性,对温度和pH适应性强,是优良的耐草甘膦菌株,通过全基因组测序及基因注释,获得抗除草剂基因aroA序列,为下一步明确基因功能,挖掘Pantoea rodasii S1536高抗草甘膦的分子机制奠定基础。     

荧光假单孢细菌培养的无细胞滤液导致松萎蔫的病状观察

将松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌混合物、致病细菌鞭毛蛋白无细胞滤液、无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌混合物接种黑松导致的松树萎蔫的病状与野生松材线虫导致松树萎蔫的病状进行观察和对比,结果为:(1)经培养的致病荧光假单孢菌GcM5-1A菌株的无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物接种导致的黑松的病状变化趋势与松材线虫致死的黑松病状是一致的;无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌AM2C混合物不能使黑松发病;(2)致病细菌GcM5-1A无细胞滤液和野生松材线虫导致的黑松病状和病程天数无显著差异;(3)接种无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物的黑松病程显著长于接种野生松材线虫的黑松.结果可以用松萎蔫病是松材线虫和其携带的细菌的复合侵染病害的假说和松材线虫与其携带的细菌之间的互惠共生关系的论点来解释,说明松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液是松萎蔫病致病的真正原因.     

中国与美国松材线虫体表细菌在线虫体表对峙及对松苗致病性

松材线虫体表的细菌存在演替现象,美国松萎蔫病危害不严重的原因可能是松材线虫体表细菌演替的结果。利用美国线虫体表的细菌来替代中国线虫体表的细菌,从而降低中国松萎蔫病的流行,为松萎蔫病的生物防治提供了可能。为此,本研究从3株美国松材线虫体表分离得到15株细菌菌株,并确定MG3、MG4、MG5、MG8、MG9、MG11、MG12为优势菌株。用中国松材线虫体表的4个致病细菌菌株YG1、YG2、YG3、YG4分别和15株美国菌株在实验室条件下进行对峙,发现美国MG4、MG5、MG8、MG9等菌株在松材线虫体表具有很强的竞争能力。用竞争能力最强的3个美国菌株MG5、MG8、MG9,混同无菌松材线虫分别对黑松、马尾松、湿地松和油松进行接种,发现相对于中国YG2菌株,美国菌株MG8和MG9对4种松树的致病性均明显较低。提出美国菌株MG8和MG9可以作为生物防治的候选菌株。      

凡纳滨对虾肠道益生菌的分离· 筛选· 鉴定

[目的]获得具有拮抗常见病原菌活性、消化酶活性且具有安全性的凡纳滨对虾肠道内源性益生菌。[方法]从健康凡纳滨对虾肠道中经过初步分离与纯化得到1 220株细菌,对分离的菌株进行拮抗试验,并对产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力进行定量和定性研究。对筛选的13株细菌进行了溶血试验和药敏试验,以评价其生物安全性。[结果]共筛选出13株抑菌活性强、产酶能力强且产酶种类多的菌株,最终确定了2株候选益生菌。菌株的16 S rDNA分子鉴定及Biolog系统鉴定结果表明,细菌3号与霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei strain WW2,JN993998.1)相似性达到98%,细菌6号与乳酸菌(Lactic acid bacterium ZJGS0109,KC748440.1)相似性达100%。[结论]研究结果为今后益生菌制剂的开发和应用奠定了基础。     

产苯乳酸乳酸菌的筛选及鉴定

[目的]研究产苯乳酸乳酸菌的筛选与鉴定。[方法]用双层培养基法从传统发酵制品中分离出115株乳酸菌,用双层平板法从中筛选出24株对啤酒酵母具有明显抑菌效果的菌株,然后通过高效液相色谱分析筛选产苯乳酸量最高的菌株,并对筛选的菌株进行形态学观察、生理生化鉴定以及菌株16S rDNA序列的测定与分析。[结果]对初筛的24株菌株发酵液进行高效液相色谱分析得到7株苯乳酸的产量〉60 mg/L的菌株,其中菌株P421乳酸菌显示出最高的苯乳酸生产能力,苯乳酸产量可达80.5 mg/L。根据菌株P421的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。[结论]从传统发酵制品中分离筛选得到1株产苯乳酸的菌株,建立了1种准确筛选苯乳酸生产菌的方法。     

菌株Serratia sp.PW7不同定殖方式对黑麦草中芘污染去除及其内生菌群的影响

为探究功能植物内生细菌对植物体内多环芳烃（PAHs）污染的去除以及机理,选择芘为多环芳烃代表、黑麦草为修复植物,采用水培体系检测内生细菌Serratia sp.PW7定殖对黑麦草体内可培养内生细菌群落和芘污染去除的影响。结果表明：菌株PW7能够高效定殖在黑麦草根（5.87~7.63 lg CFU·g^-1）和茎叶（3.49~4.97 lg CFU·g^-1）中,促进植物生长和芘的去除,改变黑麦草体内内生菌群结构,提高黑麦草体内可培养细菌总数和多样性。内生细菌定殖对植株生长与芘去除的促进作用与菌株定殖效率正相关。比较浸根和浸种两种定殖方式,浸根具有较高的定殖效率与降芘效益,还可促进植物生长。浸根定殖后,黑麦草生长量提高了18.5%~28.0%,植株体内芘浓度降低35.7%~44.2%;同时,浸根处理的黑麦草在高浓度芘污染下,根中内生细菌多样性及均匀度达到试验中的最高值（H=2.22,J=0.865）。芘污染条件下,功能菌定殖可改变植株体内优势种,定殖后黑麦草根中Serratia属成为绝对优势属,Pantoea属、Erwinia属（高浓度）和Micrococcus属次之;茎叶中优势属Microbacterium属不变,另一优势属由Chryseobacterium属变为Pantoea属（低浓度）、Pseudomona属和Sphingobacterium属。体外芘降解实验证明,有7株优势内生细菌15 d芘降解率超过55%。实验结果表明,功能菌株PW7可通过定殖提高植株体内内生细菌多样性及改变其优势种群来降低植物体内芘污染。     

植物枯萎病拮抗细菌KL-1菌株的分离及鉴定

[目的]筛选、鉴定植物枯萎病菌拮抗细菌,为植物枯萎病生防制剂的研究奠定基础。[方法]采用对峙培养法筛选对植物枯萎病菌具有良好抑制作用的生防细菌,通过Biolog细菌自动鉴定系统和16SrDNA序列分析法鉴定其分类地位,并研究该菌株对棉花和小鼠的安全性。[结果]从棉花根际土壤中分离出的12株细菌中,有5株对多隔镰刀菌、香石竹尖孢镰刀菌、棉花枯萎病菌具有拮抗活性;其中,KL-1菌株对3株目标病原菌的抑菌活性分别达69.09%、80.78%、78.89%。Biolog细菌自动鉴定系统和16SrDNA序列分析法鉴定结果表明,KL-1菌株为解淀粉芽孢杆菌;生物安全性初步测定结果表明,KL-1菌株对棉花和小鼠安全无毒。[结论]解淀粉芽孢杆菌KL-1菌株具有对多种植物枯萎病菌的抑菌活性,且对棉花和小鼠安全无毒,是一株具有研究和开发潜能的生防菌株。     

锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究

[目的]报道锦鲤的发病情况及其病原的主要生物学性状。[方法]对5尾发病及新鲜病死的锦鲤病变组织进行细菌检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性等表观分类学指征鉴定;同时择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定、健康锦鲤的人工感染试验和药敏试验。[结果]根据2株分离菌的形态特征及理化特性,结合16S rRNA序列测定与系统发育分析结果,判定其为气单胞菌属的维氏气单胞菌,其代表菌株HC050630A-1的16S rRNA基因序列长度为1457bp。人工感染试验表明,HC050630A-1株具有较强的致病作用。药敏试验结果显示,HC050630A-1菌株对供试37种抗菌药物中的头孢拉定等16种高度敏感,对头孢唑啉等13种敏感,对青霉素G等8种药物耐药。[结论]该研究为对该病的有效检验与防制等提供参考。     

拮抗根癌土壤杆菌的桃内生细菌的筛选鉴定

【目的】从对根癌病具有获得抗性(SAR)的桃单株"西北13-1"的枝条内分离鉴定内生细菌,分析其种群组成并从中筛选拮抗根癌土壤杆菌的高效生防菌,为桃根癌病的生物防治探索新方向并提供新的生防菌资源。【方法】首先,将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接种到"西北13-1"的桃树枝条上,并以无菌水接种作为对照;然后,分别于接种前、接种后10 d和接种后60 d采集接种处理和对照处理的"西北13-1"枝条。表面消毒桃树枝条样品后采用涂布平板法分离内生细菌;并结合16S r DNA序列鉴定,比对初步鉴定菌株,分析内生细菌的数量及组成差异。采用平板拮抗法、温室防病效果测定筛选拮抗根癌土壤杆菌的活性菌株,通过生理生化测定和分子鉴定,明确其分类地位。为揭示拮抗菌可能具有的其他拮抗作用机制,通过电击转化将含有GFP基因的p BBR1MCS-2质粒导入拮抗菌株中,然后进行GFP标记菌株对根癌土壤杆菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用灌根法提前接种标记菌株菌悬液,第2天接种根癌土壤杆菌菌悬液,应用激光扫描共聚焦显微镜和平板稀释法研究标记菌株在番茄根部的定殖情况。【结果】从"西北13-1"桃枝条中共分离到108株内生细菌,基于16S r DNA序列,这些菌株分别属于伽马变形菌类(Gammaproteobacteria)、阿尔法变形菌类(Alpharoteobacteria)、放线菌类(Actinobacteria)、厚壁菌类(Firmicutes)、拟杆菌(Bacteroidetes),共计5个细菌类群17个属,显示了桃树枝条中内生细菌丰富的种群多样性。其中,伽马变形菌类的肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)和根瘤菌属(Rhizobium)最多,其数量在接种根癌土壤杆菌后显著上升,包含了14株产抑菌圈的拮抗菌中的10株细菌。经鉴定,筛选出的两株抑菌活性较高、具有生防潜力的拮抗菌10DM4-1和10DI2-2分别为泛菌(Pantoea deleyi)和肠杆菌(Enterobacter cowanii),它们可显著抑制向日葵根癌瘤的形成,防治效果分别为86.08%和89.87%。标记菌株10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp灌根番茄后,可在根部细胞间隙观察到目标菌落,标记菌株的数量在0—10 d时呈现急剧下降趋势,最后保持相对稳定的较低水平(104CFU/g),说明了它们在番茄根组织内具有良好的生存和定殖能力。【结论】桃"西北13-1"的内生菌中存在着能够拮抗根癌土壤杆菌的细菌,这些具有拮抗活性的菌株与桃"西北13-1"具有根癌病抗性有关。分离得到的泛菌10DM4-1和肠杆菌10DI2-2可能通过产拮抗物质、占据根部有利生态位拮抗根癌土壤杆菌。