鸭源新城疫病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

【目的】建立鸭源新城疫病毒逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测方法,为鸭源新城疫病毒的快速诊断提供支持。【方法】选取鸭源新城疫病毒NP基因的相对保守区序列,利用Primer Explorer V4在线软件设计了3对RT-LAMP引物,以鸭源新城疫病毒SDFCH株RNA为模板进行RT-LAMP反应,通过对反应温度、时间及反应体系各组分浓度的筛选,优化反应体系和反应条件,然后对该方法的灵敏性和特异性进行检测(以RT-PCR方法为对照),并将其应用于临床病料检测。【结果】优化的RT-LAMP反应体系能够在63℃下1h内实现目标核酸区段的大量扩增,反应结果可直接用肉眼判断;建立的鸭源新城疫病毒RT-LAMP检测方法特异性较强,灵敏度较高,与其他病毒,如H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、禽偏肺病毒(aMPV)、传染性支气管炎病毒(IBV)等的核酸无交叉反应,可检测到1×10-3稀释度的目标RNA(0.1pg/μL),较普通RT-PCR的灵敏性高10倍;利用建立的鸭源新城疫病毒RT-LAMP检测方法对24份疑似鸭源新城疫样品的阳性检出率为41.7%。【结论】建立的鸭源新城疫病毒的RT-LAMP检测方法,具有快速、准确、特异性强、灵敏度高的特点。     

水环境中诺如病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

[目的]基于诺如病毒(NV)基因保守区,设计一套RT-LAMP简并引物,建立能简便、特异、灵敏检测水环境样品中NV的一步法RT-LAMP技术。[方法]通过试验,优化反应温度(64℃)、反应时间(40 min)、Mg2+浓度(2 mmol/L)等参数,建立反应体系。[结果]该方法只需1台水浴锅在1 h内即可完成检测,可直接用肉眼观察结果,检测灵敏度比普通RT-PCR高100倍;简并引物的设计增强了特异性,可检测多个血清型的NV。[结论]在样品检测中,RT-LAMP技术的灵敏度达97.7%,高于RT-PCR的90.7%,更适用于野外样品和简陋实验室的快捷检测。     

番茄黑环病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了快速有效地检测出植物样品中的番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV),根据TBRV的保守序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过试验成功建立了TBRV的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,约27 min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、番茄斑萎病毒(TSWV)及番茄环斑病毒(ToRSV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度至少高10倍;并可通过肉眼观察反应颜色的变化直接进行结果判断。该方法适用于TBRV的快速检测。     

H7亚型禽流感病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立及应用

根据H7亚型禽流感病毒的血凝素基因中的保守区域设计特异的LAMP引物。10倍倍比稀释试验表明了此方法的高灵敏性,最低可检测到100 fg的RNA。对H1、H3、H4、H5、H6、H9亚型A型流感病毒和NDV进行H7-RT-LAMP检测,并无交叉反应,说明了此方法的高特异性。利用80份临床样品对所建立的H7-RT-LAMP方法进行评价,鉴定结果和病毒分离方法一致,说明此方法的可行性。建立的H7-RT-LAMP方法简单、快速、灵敏、特异,是H7亚型禽流感病毒的一种高效检测方法,适合在基层进行H7亚型禽流感病毒的早期筛检。     

鸭I 型肝炎病毒一步法 RT-LAMP 可视化快速检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的鸭I型肝炎病毒( DHV I) VP1基因的高度保守序列,设计了特异性的引物,建立了一种灵敏、特异、高效的可视化体外环介导等温扩增方法( RT-LAMP)。结果表明,该方法的灵敏性可达到10 fg,是常规一步法RT-PCR方法的100倍以上。全部反应可以在1.0~1.5 h内完成,并可以直接通过肉眼观察颜色进行结果判定,该方法对其他鸭常见的病原体检测结果全部为阴性,该方法的建立为下一步研制鸭I型肝炎病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒打下基础。     

牛病毒性腹泻病毒一步 RT-LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法,为诊断与监测BVDV 提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套 LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测 BVDV的 RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100 copies/μl的病毒 RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。     

李属坏死环斑病毒（PNRSV）RT-LAMP检测方法的建立

针对李属坏死环斑病毒（PNRSV）外壳蛋白（CP）基因保守序列,设计了1套特异性识别CP基因中6个不同区段的环介导等温扩增（LAMP）引物。通过对反应条件的优化,建立了适用于PNRSV的RT-LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,此方法能够特异性的检测出PNRSV,对马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、蚕豆萎蔫病毒（BBWV）的检测均为阴性,灵敏度高于RT-PCR 10倍。     

反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。     

食品中金黄色葡萄球菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

【目的】金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌,主要经食品传播,引起食物中毒、组织及器官的化脓性炎症,建立快速、准确的检测方法对预防和控制金黄色葡萄球菌的传染具有重要意义。【方法】DNA环介导恒温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新颖的快速、高灵敏核酸扩增技术,本研究利用该技术建立金黄色葡萄球菌LAMP检测方法。基于金黄色葡萄球菌高度保守的Sa442基因序列,设计4条特异性LAMP扩增引物,两条外引物F3和B3及两条内引物FIP和BIP,在BstDNAPolymerase作用下,65℃恒温水浴中,对26个种类共45株细菌进行扩增,所试的20株金黄色葡萄球菌均为LAMP阳性,说明所设计的LAMP引物具有高度特异性。【结果】本LAMP方法对纯培养的金黄色葡萄球菌检测灵敏度为25CFU/mL,对污染食品中金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为42CFU/g,40—60min内即可完成检测。检验检疫实践证明,利用本LAMP方法对958份肉类、蛋奶及其制品、人工污染样品等进行检测,检出115份LAMP阳性,与国标法(GB)检测结果一致。【结论】本LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

 【目的】建立转基因作物外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法。【方法】以转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S）为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,针对CaMV35S基因的6个区域设计4种特异引物,利用1种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对转基因作物鉴定工作。同时对7种转基因作物进行LAMP检测。【结果】该LAMP方法通过特异性检测含有CaMV35S启动子的转基因作物,其检测结果的特异性与常规PCR方法结果一致,灵敏度是常规PCR的10倍。【结论】转基因作物LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因作物的快速检测,有较好的应用价值。     

抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用

以转基因Bt水稻品种科丰6号为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cry1Ac晶体蛋白毒素基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃保温30min,通过荧光显色完成对转基因检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cry1Ac基因,其最低定性检测限是传统PCR方法的10倍。本研究建立的针对转基因水稻cry1Ac基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合转基因抗虫水稻的快速检测。     

Development of a Synthetic Peptide ELISA Assay for the Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus Nonstructural Protein Antibodies

In order to develop an ELISA assay with synthetic peptides for the detection of antibody to the nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus, specific peptides were synthesized by a solid-phase method according to FMDV NSPs B-cell epitopes, and were conjugated to carrier protein BSA. An ELISA system was developed to detect FMDV NSPs antibody with the conjugated proteins as the coating antigen. The optimal coating concentration of the antigen was determined as 2.5 μg mL-1. The comparative study of this assay with UBI NSP ELISA kit and national commercial 3ABC ELISA kit in the detection of 199 serum samples showed that they were very coincident, and the identity rates were 96.48 and 97.48%, respectively. The development of ELISA using the synthetic peptides as coating antigen is specific, reproducible, stable, and easy, and can be used to differentiate FMDV infected pigs from immunized pigs.