柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

 甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。     

柑橘溃疡病菌gpd1基因在致病性中的功能分析

 甘油作为微生物重要的能量来源及抗逆因子,对其生存具有重要作用。gpd1基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH),是甘油合成代谢途径中关键的限速酶。本研究分析了gpd1基因在柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc)致病性中的功能。对Xcc强毒菌株Xcc021和弱毒菌株Xcc049E分别进行了gpd1的缺失突变,发现gpd1缺失仅影响强毒菌株Xcc021在感病柑橘寄主上的毒性以及gpd1缺失影响Xcc在营养贫乏培养基中的生长能力,功能互补子能够恢复毒性和生长能力至野生型水平。其他毒性相关表型显示:与野生型Xcc021相比,gpd1突变体菌体的沉降能力增加,游动性降低,生物膜形成能力增强,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。这表明gpd1基因在强毒菌株中是重要的毒性因子,其涉及的甘油代谢途径可能在强弱毒菌株对于寄主柑橘的毒性具有不同的作用。     

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究

 硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)化学诱变水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)日本系统III号小种(JXOIII),获得16株hrp-突变体,其在感病寄主水稻IR26、汕优63上失去致病性和在非寄主烟草上失去过敏反应。所得的hrp-突变体并无黄色素缺失现象。16株hrp-突变体的淀粉酶、果胶酶、蛋白酶、纤维素酶和脂酶等胞外酶活性基本与野生型一致。JCM2092、JCM2211、JCM2252和JCM2457这4株hrp-突变体为III型泌出通道突变体,JCM0066等另12株hrp-突变体的超声波破碎液、离心上清液中无激发HR的信号物质存在。细胞组分分析表明,激发烟草HR的信号物质不是LPS而是蛋白类物质。来自JXOIII基因文库hrp基因克隆pUHRX245中的1.1kb SacI-KpnI片段,能够互补hrp-突变体JCM0066和JCM2482,使其恢复在烟草上激发HR的能力,但不能恢复其致病性。     

苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)果胶裂解酶基因Bdpl1的致病功能分析

 由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的苹果轮纹病是影响我国苹果安全生产的重大病害之一。因此,本研究基于受苹果轮纹菌侵染的苹果组织中果胶裂解酶基因Bdpl1表达上调这一现象,通过Split-marker PCR技术构建Bdpl1基因敲除载体,并通过PEG介导的原生质体转化获得转化子,经常规PCR和qRT-PCR对所获得的转化子进行筛选,成功获得1个Bdpl1基因缺失阳性突变子。该转化子在PDA上的培养基性状与野生型没有明显差异,但在果胶培养基上菌落直径明显小于野生型。其胞外果胶酶活相比野生型明显下降,但在离体“早富”苹果枝条上的致病力并没有明显的下降。通过qRT-PCR技术发现在基因Bdpl1敲除后,其家族内有3个基因在病菌侵染过程中相比野生型明显上调表达(>3倍)。这些现象表明果胶裂解酶基因Bdpl1与病原菌的营养生长过程关系不大,但其参与对寄主果胶类物质的降解。Bdpl1基因对轮纹病菌致病力的影响较小,有可能是Bdpl1基因敲除后,该基因家族内其他基因的上调表达补偿了Bdpl1基因的功能。     

一株拮抗水稻白叶枯病菌的淡紫灰链霉菌的筛选鉴定及其生防效果研究

 为发现绿色安全的水稻白叶枯病天然生物防治微生物,本研究从植物根际土壤中分离获得165株放线菌。利用共培养法和牛津杯法,筛选获得了5株拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的放线菌,其中拮抗能力最强的是Sl-10菌株,发酵液抑菌圈直径为62.1 mm ± 1.5 mm。根据形态特征、生理生化实验、16S rDNA序列和系统发育分析,鉴定Sl-10菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。Sl-10菌株发酵液对大豆斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. glycinea)、烟草野火病菌(P. syringae pv. tabaci)、油菜黑腐病菌(X. campestris pv. campestris)、大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)、水稻条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番茄叶斑病菌(P. syringae pv. tomato)7种植物病原细菌均有拮抗作用。Sl-10菌株发酵液具有较好的耐光、耐酸碱和热稳定性。SDS-PAGE电泳结果显示,Sl-10菌株可抑制Xoo的蛋白质合成。4个品种水稻(甬优15、湘两优900、嘉丰2号和甬优1540)喷施Sl-10菌株发酵液,水稻白叶枯病的病斑抑制率达到82.27%~91.78%。研究结果显示,淡紫灰链霉菌Sl-10菌株具有较好的水稻白叶枯病生物防治潜能。     

稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8的特性分析

 有性生殖在真菌的生活史和进化过程中具有重要作用,而交配型基因是控制有性生殖的关键因子。前期研究发现稻曲病菌(Villosiclava virens)MAT1-2型菌株中包含MAT1-2-1和MAT1-2-8两个交配型基因,但是它们如何调控稻曲病菌有性生殖依然不清楚。本文研究了它们在不同侵染和生长发育时期的表达模式和编码的蛋白结构特性。研究表明MAT1-2-1在侵染不同阶段一直下调表达;而MAT1-2-8在侵染早期(5 dpi)上调表达,在侵染后期下调表达。与营养菌丝阶段比较,MAT1-2-1和MAT1-2-8在有性发育过程菌核形成、菌核萌发、子座原基形成和子座成熟4个阶段的表达量都是下降的,在菌核形成阶段表达量最低。生物信息学分析显示MAT1-2-1和MAT1-2-8具有磷酸化位点,为非分泌蛋白,无明显的跨膜结构域。蛋白同源比对分析表明MAT1-2-1与香柱菌(Epichloë typhina)的MAT1-2-1同源性最高,而MAT1-2-8与绿僵菌(Metarhizium)的MBR_08192蛋白同源性最高。进一步研究发现MAT1-2-1和MAT1-2-8能够互作,并分别主要定位在细胞核和细胞基质中。通过质谱技术鉴定到MAT1-2-1的一些候选互作蛋白,如假定Ran交换因子Prp20/Pim1(KDB12229.1)、假定rRNA处理蛋白Ebp2(KDB12923.1)及组蛋白H1(KDB12711.1)等。因此,以上结果为研究稻曲病菌交配型基因MAT1-2-1和MAT1-2-8调控有性生殖的生物学功能奠定了基础。     

III型分泌系统是欧美杨溃疡病菌Lonsdalea quercina重要的致病因子

 欧美杨溃疡病是由Lonsdalea quercina(原称Brenneria quercina,Erwinia quercina)引起的一种细菌性病害,2005年首次在我国河南发现,对我国杨树产业造成了严重影响。菌株N-5-1是从河南濮阳自然发病杨树枝条上分离到的致病菌株。根据N-5-1菌株全基因组测序的初步结果分析,发现N-5-1具有完整的III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)。该系统与植物病原菌Erwinia amylovora CFBP1430和Dickeya dadantii 3937的T3SS高度相似,共由26个基因编码,共约23 kb,其中9个为保守的hrc基因。将L. quercina N-5-1菌株T3SS中保守的结构基因hrcV进行缺失突变,生物测定发现ΔhrcV突变体对“中林46杨”(Populus ×euramericana ‘Zhonglin 46’)2年生枝条的致病力明显下降,而互补菌株HBhrcV致病力与野生菌株保持一致。表明该菌中T3SS是病原细菌重要的致病性因子。菌株N-5-1中hrcV基因的突变导致诱导烟草过敏性坏死反应能力丧失,但并没有影响菌株的生长速率、游动性和生物膜的形成。本研究首次证明了L. quercina N-5-1菌株的T3SS是重要的致病因子。     

2014年海南省橡胶炭疽病菌对多菌灵和咪鲜胺的敏感性测定

 2014年从海南省4个市(县)分离获得43株橡胶炭疽病菌,进行病原菌鉴定后,采用菌丝生长速率法,测定了其对多菌灵和咪鲜胺的敏感性,结果表明:供试菌株中,有23个属于胶孢炭疽病菌,20个属于尖孢炭疽病菌。所有供试菌株对多菌灵和咪鲜胺的EC₅₀值分布范围分别为(0.332 3~7.425 6)和(0.009 1~0.113 3) mg·L^-1,平均值分别为(1.714 1±1.684 7)和(0.036 8±0.023 8)mg·L^-1。其中尖孢炭疽病菌对多菌灵的EC₅₀值要显著高于胶孢炭疽病菌,EC₅₀平均值分别为(2.922 7±1.556 3)和(0.663 2±0.194 4)mg·L^-1,但2种病原菌对咪鲜胺的EC₅₀值没有显著差异,EC₅₀平均值分别为(0.038 3±0.015 2)和(0.035 5±0.020 1)mg·L^-1。供试菌株对多菌灵和咪鲜胺的敏感性无显著相关性,可以在生产上交替使用。     

利用gusA基因在水稻组织中示踪和定量水稻白叶枯病菌的方法

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)从自然孔口水孔或者伤口处侵入水稻叶片,在维管束中定殖、繁殖和扩展,引起典型的叶枯症状。可视化这个动态的病程过程和快速定量水稻组织中细菌的群体是Xoo-水稻互作研究中亟待突破的技术难点。本研究在PXO99^A菌株中表达gusA基因,将其置于lacZ启动子、hrpX启动子和不含有(T₁)₄终止子的hrpX启动子下,构建了3个示踪菌株PXO99^A_GUSRBS、PXO99^A_GUSX和PXO99^A_GUSX-。水稻上毒性测定结果显示,这3个示踪菌株与野生型PXO99^A展现相同的毒性。利用示踪菌株,通过注射接种法,能够观察到Xoo在水稻维管束中定殖和扩展的动态变化;通过喷雾接种法,能够观察到Xoo从叶尖或者叶缘侵入水稻叶片引起发病的特性;发现PXO99^A_GUSX和PXO99^A_GUSX-比PXO99^A_GUSRBS能够更加灵敏地反映这些病程。同时发现,PXO99^A_GUSRBS的细菌数量与受其侵染的水稻组织的GUS活性显著正相关。本研究也评价了利用GUS活性测定法精确和快速地定量水稻组织中细菌群体的可行性。以上结果表明这套GUS系统是非常有效的,能够示踪病原菌的侵染过程和监测细菌在水稻组织中的群体数量,这将为Xoo-水稻互作研究提供有力的技术支持。     

云南药用野生稻对四种水稻主要病害的抗性鉴定

 对云南药用野生稻7个不同居群的稻瘟病、纹枯病、白叶枯病和细菌性条斑病抗型表型进行鉴定,筛选抗源,并检测已克隆的抗稻瘟病、抗白叶枯病基因在它们中的存在情况。结果表明:用云南稻瘟病菌毒性菌株16t接种云南药用野生稻7个居群,除勐海药野(7)表型为感病外,其他6个居群均为抗病;勐遮药用野生稻(4)和景纳上沟药用野生稻(1)分别不含Pib和Pi2基因片段,其他5个居群都含有Pib、Pi2、Pi9、Pid2、Pikp、Pis和Pi56等基因片段;所有的参试药用野生稻高抗纹枯病;除勐往药野(13)和澜沧孟矿药野(14)对细菌性条斑病菌菌株RS105表现为感病和勐遮药野(5)对菌株RS1-20表现为感病外,其他材料对菌株RS105和RS1-20都表现为抗病;云南白叶枯病菌强致病性菌株CX30-1、菲律宾菌株PXO99和PXO86对景纳上沟药用野生稻(1)和澜沧孟矿药用野生稻(14)具有强致病性,其他居群表现为抗病至中抗;7个居群都含有Xa5、Xa13、Xa21基因片段。本文首次报道了云南药用野生稻多个居群类型对4种主要病害的抗性,这些结果为深度挖掘利用云南药用野生稻资源的有效抗病基因奠定了基础。     

草酸对重寄生真菌盾壳霉分生孢子萌发和菌丝生长的影响

 本文研究了草酸对核盘菌的重寄生真菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)分生孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明:草酸对盾壳霉分生孢子萌发没有明显促进作用,在酸碱性非缓冲基质(水琼脂)和酸碱性缓冲基质中,抑制盾壳霉分生孢子萌发的最低浓度分别为150和700μg/mL。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中,当草酸浓度为100~2000μg/mL时,盾壳霉菌丝能够生长,且浓度为300~500μg/mL的草酸对盾壳霉的菌丝生长具有明显的促进作用。在以草酸为唯一碳源的合成培养基中,在酸碱性非缓冲的条件下,当草酸浓度为100~2000μg/mL时,盾壳霉菌丝能够生长,且草酸浓度为500μg/mL时对盾壳霉菌丝生长具有促进作用,而当草酸浓度为2500μg/mL时,盾壳霉菌丝则停止生长。在酸碱性缓冲的合成基质中,草酸浓度为100~4000μg/mL时,盾壳霉菌丝能够生长,且草酸浓度为1500~2500μg/mL时对盾壳霉菌丝生长具有促进作用。在含草酸钙的混浊培养基(以草酸为唯一碳源)上,盾壳霉菌落区域形成了透明圈。上述结果说明盾壳霉能忍耐一定浓度的草酸而进行分生孢子萌发及菌丝生长,且这种真菌可能对草酸分子具有分解作用。     

禾谷镰孢单端孢霉烯族毒素在小麦组织中的积累

 本试验将禾谷镰孢一高产毒菌株B4-1采用单小花注滴法接种于小麦抗赤霉病品种苏麦3号和感病品种宁麦6号,用气/质联检法测定接种后4、8、12、16和20 d组织中的单端孢霉烯族毒素积累量。结果显示,在病组织中有脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol,15-ADON)和3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol,3-ADON)等3种单端孢霉烯族毒素,但未发现雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol)和镰刀菌酮-X (fusarenon-X)等毒素。抗病品种病穗组织中,DON平均含量由接种后4 d的29.5 μg/g dry weight (gdw)下降到20d时的15.7μg/gdw,15-ADON和3-ADON量则较低,分别为1.5~3.6μg/gdw和<1.7μg/gdw;而同期感病品种病穗组织中的DON量则由23.1μg/gdw上升到47.7μg/gdw,15-ADON和3-ADON量均较高,分别达8.6~10.0μg/gdw和2.6~8.3μg/gdw。在抗、感病品种无症状穗组织中,3种毒素的含量均很低(<0.5 μg/gdw)。同时,本研究还首次在感病品种的穗颈(总花梗,peduncle)组织中检测到大量的DON和15-ADON及少量的3-ADON。     

化学合成寡糖诱导烟草抗黑胫病的初步研究

 抑菌测定和盆栽试验表明:化学合成的Lewis^x和Lewis^a寡糖对烟草黑胫病病原菌菌丝生长无明显影响;Lewis^x五糖和七糖处理烟草,可使烟草植株产生对黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)的抗性,在处理浓度0~10μg/m L内,随着浓度增高诱导效果增强,当浓度达10 μg/m L时,诱导防病效果达90%以上。Lewisx七糖处理,可导致烟草叶片过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸裂解酶(PAL)等防卫酶活性不同程度地提高,PPO、POD及PAL分别在处理后第4d、第6d和第8d达到最大值,比对照分别增加了70.7%、150.0%和142.8%。     

二硫氰基甲烷对水稻恶苗病菌菌体作用机理研究

 有机硫氰化合物二硫氰基甲烷(TH-88,浸种灵)可抑制水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)对多菌灵(carbendazim)的抗性菌株和敏感菌株,EC50在0.393 3~1.641 2 μ g/ml之间,对菌丝和分生孢子的形态没有影响;该药剂(浓度为1 μ g/ml)对菌体的生物膜(透性)有一定抑制作用;用药剂处理萌芽期、非萌芽期的分生孢子及其初形成的菌丝,结果表明:药剂对菌丝和分生孢子的呼吸作用有影响,以分生孢子萌芽期最为敏感,用二硫氰基甲烷2 μ g/m l处理刚萌芽的分生孢子5 m in,呼吸作用比对照低64.15%;处理NADH细胞色素还原酶和NADH细胞色素氧化酶,前者没有影响,但对后者有54.32%的抑制。用二硫氰基甲烷(1 μ g/ml)处理啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的线粒体,呼吸控制速率(RCR)比对照低27.67%;磷氧比(P/O)比对照低9.3%。     

禾谷镰孢菌对多菌灵的敏感性基线及抗药性菌株生物学性质研究

 引起小麦赤霉病的禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)在华东地区对多菌灵已出现了高水平抗药性。本文报道了F.graminearum对多菌灵的敏感性基线及其抗药性菌株生物学特性。离体条件下多菌灵对100个野生敏感型菌株的平均EC₅₀和MIC值分别为0.5748±0.0133 μg/ml和 < 1.4μg/ml。而对50个抗药性菌株的平均EC₅₀和MIC值则分别为9.2375μg/ml和 > 100 μg/ml。在麦穗上多菌灵对50个敏感菌株和抗药性菌株防效的平均EC₅₀分别为282.6 μg/ml和 > 2 000μg/ml。从田间获得的抗多菌灵菌株对苯菌灵、噻菌灵、甲基托布津表现交互抗药性,但不同于室内突变菌株,对乙霉威不表现负交互抗药性。抗药性菌株的无性和有性繁殖后代以及在无药培养基上菌丝体转代培养后,抗药水平保持不变。抗药性菌株的菌丝生长速率、产孢能力及致病力等与敏感菌株相比没有差异。     

微管、微丝特异性抑制剂处理对水稻抗病性的影响

 微管特异性抑制剂oryzalin、微丝特异性抑制剂细胞松弛素A (cytochalasin A,CA)和细胞松弛素D (cytochalasin D,CD)的试验表明:oryzalin在5~50μmol/L、CA在0.5~1.0μg/mL、CD在1~20μg/mL的浓度范围内,对稻瘟病菌孢子的萌发和附着胞的形成基本上没有影响。采用以上几种细胞骨架特异性抑制剂处理水稻叶鞘都可以不同程度地抑制寄主细胞抗病菌扩展的能力。在抑制剂处理的水稻叶鞘细胞中,病菌扩展的速度加快。进一步的观察发现,抑制剂处理抑制水稻细胞抗病菌的扩展能力与水稻的抗病防卫反应如原生质颗粒化、多酚类物质的积累和HR发生的延迟是相关的。     

几丁质和杀菌剂对生物防治菌生长及其防治棉花病害效果的影响

 研究了化学杀菌剂对木霉菌生长的影响,探讨了几丁质添加物对绿色木霉菌菌株L R、LTR-2、哈茨木霉菌菌株Q1、Q2和粉红粘帚霉菌菌株GLR防治棉花病害效果的影响。多菌灵、苯菌灵和甲基硫菌灵在1.66μg/ml时可以完全抑制Q1和Q2的生长,但在2.68μg/ml时才能完全抑制LR和LTR-2的生长。几丁质添加物使L TR-2和Q1防治棉花立枯病的效果完全丧失,但是能使LR从没有防治效果提高到防治效果为34.6%,而对粉红粘帚霉菌的防治效果没有显著影响;对于防治棉花黄萎病来说,几丁质添加物使木霉菌LR、LTR-2和GLR的防治效果降低,但是提高了Q1的防治效果;对于防治棉花枯萎病来说,几丁质添加物能提高所有测定菌株的防治效果。说明不同的生物防治菌株、添加物和病害组合对于获得良好的防治效果是重要的。     

对细交链孢菌在培养基上抗多氧霉素B与异菌脲变异体的分离及其特性鉴定

 将多氧霉素B感性细交链孢菌置于含100μg/ml多氧霉素B的PDA平板上培养时,从长出的菌落边缘菌丝体中可分离到抗多氧霉素B的变异体,而将其异菌脲感性菌株接种在含100 μg/ml异菌脲的PDA平板上培养时,只有约半数供试菌株能稳定地分离出抗异菌脲变异体。在多氧霉素B存在下分离的抗多氧霉素B变异体对异菌脲的敏感性通常大于其母本菌株。相比之下,在异菌脲存在下分离的抗异菌脲变异体对多氧霉素B的敏感性没有发生明显变化。对多氧霉素B与异菌脲均为感性的野生型菌株不能在这2种药剂共存的PDA平板上生长,且其分生孢子对多氧霉素B与异菌脲分别呈感性集中型及抗感分散型分布。     

柑橘溃疡病菌外膜蛋白XAC1347在耐受铜杀菌剂中的功能

 细菌性溃疡是柑橘上的一种重要细菌病害,施用含铜化学药剂是防治该病的主要措施。本研究报道柑橘溃疡病菌外膜蛋白XAC1347在铜化学药剂耐药性中的功能。在平板抑菌试验中,46% Cu(OH)₂散粒剂和33%王铜·Cu(OH)₂悬浮剂的的最大稀释倍数分别为2 000倍和2 500倍,相对应的有效成分氢氧化铜和王铜的浓度分别为0. 023%和0.013 2%时,柑橘溃疡病菌的生长受到抑制。在2 000倍稀释浓度条件下,两种杀菌剂对外膜蛋白XAC1347突变体的抑菌圈分别增加了10倍和5倍。接种柑橘植物后,突变体ΔXAC1347中耐铜基因copA和copB基因的表达水平分别下降了37%和15%;在铜离子胁迫条件下,copA和copB基因的表达水平分别下降了33%和51%。在突变体中组成型表达XAC1347基因,均能部分恢复突变体的表型。这些结果表明,外膜蛋白XAC1347对柑橘溃疡病菌耐受含铜杀菌剂有重要作用。