用间接血凝反应和环卵沉淀试验诊断耕牛日本血吸虫病

用间接血凝反应和环卵沉淀试验诊断耕牛日本血吸虫病应长沅（浙江省临安县农业局，３１１３００）许平荣（临安县昌化农技站）１９７６～１９７７年，上海家畜血研所在浙江省江山县和临安县采用间接血凝反应（简称“血凝法”）、环卵沉淀试验（简称“环沉法”）与常规粪孵...     

环沉反应法、琼脂扩散反应法和对流免疫电泳法检查生皮炭疽的对比试验

检验生皮炭疽,国内外多采用阿斯柯里氏(Ascoli)环状沉淀反应法(以下简称环沉反应法),但此法要求检验材料浸出液和沉淀索血清清晰透明,否则无法判定结果。为探讨一种快速、准确、操作简便的方法,三年     

用间接血凝反应诊断耕牛日本血吸虫病的体会

根据1976年至1977年上海家畜血研所在浙江省江山县和临安县采用间接血凝反应、环卵沉淀反应、常规粪孵法诊断牛日本血吸虫病的现场比较试验,共剖检17头粪孵法为阴性而免疫法(间接血凝反应和环卵沉淀反应)为阳性的牛,结果其中7头剖检到日本血吸虫。为了提高日本血吸虫病牛的检出率,加快消灭该病的步伐,我们在上海家畜血研所的热情支持、帮助和指导下,在用常规粪孵法普查耕牛日本血吸虫病的基础上,推广应用间接血凝反应诊断耕牛日本血吸虫病。自1978年起,全县用间接血凝反应检查42429头,其中阳性牛1127头,并对阳性牛用硝硫氰氨、吡喹酮进行治疗,使我县很快达到基本消灭牛日本血吸虫病的目的。1984年至今没有粪检到日本血吸虫病     

加环引物LAMP法快速检测布鲁氏杆菌方法的研究

研究以布鲁氏杆菌保守的OMP25蛋白基因为靶基因,设计了6条LAMP特异性引物,同时探讨了加环引物对LAMP的影响,通过优化LAMP体系的反应条件,建立了一套快速检测布鲁氏杆菌的新方法。LAMP扩增产物可通过凝胶电泳和荧光显色进行判定。该研究比较了LAMP法和加环引物LAMP法的灵敏度,并检测了其引物特异性。试验结果显示,普通LAMP法的灵敏度为20CFU/mL,加环引物的LAMP法的灵敏度为2.0CFU/mL。通过两种方法的比较可知:LAMP法可以快速、直观、准确地检测布鲁氏杆菌,加环引物可进一步提高LAMP的扩增效率,是一种在基层现场有广泛应用前景的检测方法。     

用间接血凝反应和环卵沉淀试验诊断耕牛日本血吸虫病

用间接血凝反应和环卵沉淀试验诊断耕牛日本血吸虫病应长沅（浙江省临安县农业局，３１１３００）许平荣（临安县昌化区农技站）笔者在上海家畜血吸虫病研究所指导下，在用常规粪孵法普查耕牛日本血吸虫病的基础上，应用间接血凝试验（简称“血凝法”）和环卵沉淀试验（简...     

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64 ℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。     

环病毒2型诊断技术研究进展

综述近年来在环病毒2型诊断技术方面所取得的研究进展以及研究成果。笔者查询与分析近年来有关环病毒2型诊断技术方面对应的学术研究成果以及期刊文献资料并对技术进展进行归纳与总结。当前对环病毒2型的诊断可以通过病毒抗原检测技术或者是病毒抗体检测技术的方式实现,前者技术分支包括间接免疫荧光法、以及聚合酶连反应法在内,后者技术分支包括竞争性酶联免疫吸附试验法、以及间接性酶联免疫吸附试验法在内。在对环病毒2型进行诊断的过程当中,病毒抗原检测以及病毒抗体检测均具有确切诊断效果,相关技术有待通过实验室以及实践分析的方式,验证其可行性与操作优势。     

民和县荷斯坦奶牛布鲁氏杆菌病的调查

采用不同的检测方法,对高寒地区荷斯坦奶牛(以下简称奶牛)布鲁氏杆菌病进行调查:(1)该地区布鲁氏杆菌病感染率为0.18%;(2)采用乳环沉淀反应法可对产乳奶牛进行初筛,阳性者用试管凝集反应确诊;(3)虎红平板沉淀反应法可代替试管凝集反应法诊断奶牛布鲁氏杆菌病,因二者符合率高,准确性高,可减少实验室工作量。     

猴源环孢子虫巢式PCR检测方法的建立

环孢子虫是一类可引起人和动物腹泻的重要寄生性原虫。为建立猴源环孢子虫的巢式PCR检测方法,根据该环孢子虫18S rDNA基因序列,设计一对保守引物N18SA/N18SS和一对特异性引物CYJS/CYJA,通过阳性质粒摸索该检测方法的最佳反应条件,进行特异性和敏感性试验,并应用该方法对87份猴粪样本进行了临床检测。结果显示该巢式PCR能特异性地扩增出猴源环孢子虫目的片段,与微小隐孢子虫、阿米巴原虫等8种DNA无交叉反应,最低能检测0.2 fg的阳性质粒DNA,对临床样本的检出率比传统方法(饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法)提高2.3%~3.4%。可见,该巢式PCR方法具有较高的特异性和敏感性,对于环孢子虫病的诊断和分子流行病学调查具有重要的应用价值。     

实验猴沙门菌可视环介导等温扩增检测方法的建立及应用

为了促进环介导等温扩增(LAMP)技术的推广应用,在传统LAMP反应体系中引入羟基萘酚蓝指示剂,建立可视LAMP方法,对反应体系进行高温-低温前处理和添加甜菜碱等优化措施提高检测敏感性,液面覆盖矿物油降低气溶胶污染,据此建立的猴沙门菌可视LAMP检测方法敏感度为6CFU/反应(25μL体系),结果判定直观明了,与其他细菌无非特异性反应,检验效率和检出率均优于细菌培养鉴定法。     

应用环卵沉淀反应检测山羊日本血吸虫病和治疗羊体内抗体消长规律的研究报告

通过几年的实践证明,应用环卵沉淀反应(简称“环试”)诊断耕牛日本血吸虫病是一种快速、简便、省成本、检出率高的方法。又据上海农科院畜牧所的试验报道:“环试”与病牛体内抗体消长规律密切相关。但是,     

犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别检测RT-LAMP方法的建立

为建立一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP),本研究通过比对野毒株与疫苗株H基因设计特异性引物,对反应体系中的Mg2+、Betaine、Bst DNA Polymerase、dNTP和反应温度等条件分别进行优化,建立用于鉴别检测CDV野毒株与疫苗株的RT-LAMP。建立的RT-LAMP方法检测CDV野毒株时,在65℃水浴锅中反应40 min即可完成。该方法具有高度特异性,对犬细小病毒、犬腺病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒无交叉反应,敏感度可达40 copies/μL,是常规RT-PCR方法的100倍。     

兽用喹诺酮类药物奥比沙星抑菌试验研究

本试验以五氟苯甲酰氯为起始物，通过与丙二酸单乙酯钾盐加成、原甲酸三乙酯消去反应，与环丙胺缩合，然后成环，水解，加上哌嗪基取代反应合成出第三代动物专用氟喹诺酮类药物奥比沙星，产物通过琼脂扩散法对大肠杆菌菌株（E．coli）、金葡萄球菌菌株（Goldau Teus）、肺炎双球茵菌株（Pneumococcus）、波氏杆菌菌株（Bordetella bronchiseptica）进行体外抗茵活性试验，表明其具有较好的抑茵效果。     

志贺氏菌可视浊度/荧光环介导等温扩增方法的建立

为给实验室和现场检测提供一种快速且易于操作的志贺氏菌检测方法,通过将LAMP技术分别与荧光检测技术和浊度检测技术相结合,建立了灵敏、特异、准确的可视浊度/荧光环介导等温扩增(LAMP)检测方法。根据志贺氏菌基因保守序列,利用LAMP在线软件设计4条最佳引物,通过优化反应温度,分别建立了可视浊度环介导等温扩增检测方法(LAMP-浊度)以及可视荧光环介导等温扩增检测方法(LAMP-荧光),并分析所建立的两种方法的特异性和灵敏度。结果显示:所建立的LAMP-浊度方法最适反应温度是63℃,菌液灵敏度为13.6 cfu/mL,是普通PCR方法的10倍;所建立的LAMP-荧光方法最适反应温度是64℃,菌液灵敏度为1.36 cfu/mL,是普通PCR方法的100倍。利用4株志贺氏菌和10株非志贺氏菌,证实了建立的两种可视化LAMP方法具有良好的特异性。通过环介导等温扩增技术分别与浊度检测技术和荧光检测技术相结合,使其完成时间缩短至1 h内,整个扩增过程可实时监测,并可避免由于开盖加染料而导致的假阳性。     

猪细环病毒PCR-DHPLC检测技术的建立及应用

为了应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测猪细环病毒1型和2型,根据猪细环病毒的序列特点设计特异性引物,PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测。选择猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和猪伪狂犬病毒进行特异性试验,无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和重复性;用质粒标准品进行TTSuV1和TTSuV2的PCR-DHPLC检测,灵敏度可达1.0×101拷贝·μL-1。对80份血清样本分别应用实时荧光PCR法、PCR-凝胶电泳法及本文所建立的PCR-DHPLC法与进行检测,发现TTSuV1有63份PCR-DHPLC阳性,63份实时荧光PCR阳性,54份PCR-凝胶电泳阳性;TTSuV2有69份PCR-DHPLC阳性,69份实时荧光PCR阳性,56份PCR-凝胶电泳阳性。本试验建立的PCR-DHPLC法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于TTSuV感染的分子流行病学调查。     

环介导等温扩增技术在动物病原检测中的应用

环介导等温扩增技术（LAMP）是一种依赖于自动循环的链置换技术,在等温条件下,不到1h就能扩增出10^9-10^10靶序列拷贝。该技术快速准确、操作简单、特异性强、灵敏度高,已经被用于动物病原微生物的快速检测。本文就LAMP法的反应原理、技术特点及其在动物病原快速检测中的应用作一综述。     

检测蜜蜂囊状幼虫病毒环介导等温扩增技术的建立

为建立一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病毒(SBV)的环介导等温扩增方法(LAMP),本研究根据SBV-UK株多聚蛋白基因序列(AF092924.1)设计了4条特异性引物,通过LAMP real-time Turbidimeter仪对SBV的反应体系和反应条件进行检测和实时监控,并评价其特异性、敏感性、重复性和稳定性。结果显示,在63℃恒温扩增40 min后,仅SBV核酸扩增,而其他病毒均呈阴性。反应结束后在反应体系中加入SYBR Green I的可视化判定结果与real-time Turbidimeter仪检测结果一致;该方法具有较强的特异性和较高的敏感性,其最低检出量为3.2×10~1拷贝/μL,是普通PCR的100倍;对同一批次和不同批次提取的SBV核酸进行扩增,结果表明重复性和稳定性良好;临床样品检测结果表明LAMP法与常规PCR法检测结果一致。本研究建立的LAMP方法操作简便,适用于SBV的快速检测。     

禽新型黄病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立了一种适用于禽新型黄病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法。根据禽新型黄病毒E蛋白基因序列,在保守区设计了一套针对禽新型黄病毒基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果表明该方法对NDRV、GPV、MDRV、NDV、ILTV、FPV均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,45min内可完成反应;该方法对禽新型黄病毒RNA的最小检测限为1pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的100倍。本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行禽新型黄病毒的快速检测。     

牛环形泰勒虫ELISA裂殖体抗原制备和应用研究

本文报道了牛环形泰勒虫(Theileria annulata(简称环泰虫)裂殖体抗原的制备和ELISA在诊断环泰虫病、检测免疫牛抗体水平和确定虫种间血清学关系等方面的应用。应用冻融研磨法制备的抗原进行ELISA,检测25头份带虫牛血清,阳性符合率为96％,检测30头份阴性牛血清,阴性符合率为100％;一个样本重复性试验的变异系数为9.52％,多个样本重复试验的结果基本一致。表明ELISA具有较高的特异性和重复性,ELISA检测环泰虫疫区牛,阳性检出率为61.02％(镜检法为38.98％)。ELISA值的高低,与环泰虫带虫牛的红细胞染虫率呈正相关。检测49头份非疫区牛血清,结果均为阴性。用作检测免疫牛抗体水平,32头份重环泰虫裂殖体细胞胶冻苗免疫的牛血清,7个月后ELISA值仍明显高于健牛(未免疫),有62.5％在阳性范围内。检测其他种属虫体血消.不与伊氏锥虫、贝氏贝诺孢子虫和牛肉孢子虫血清发生交叉反应。检测瑟氏泰勒虫血清,有11/12的阳性反应率,初步证实环泰虫与瑟氏泰勒虫有密切的血清学关系。     

羊痘病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

为建立羊痘病毒(CaPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中羊痘病毒的保守基因序列,设计出针对羊痘病毒的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪优化得到病毒核酸等温扩增最佳条件是62 ℃恒温反应60 min。在此条件下,病毒核酸的最低检测含量为3.1×10^-2 pg/μL,灵敏度比OIE推荐的PCR方法高10⁴倍。添加钙黄绿素(calcein)建立的目测法,还可实现对上述病原体检测结果肉眼观察。本研究获得的CaPV LAMP仪器法和目测法可特异性地扩增羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒核酸,具有反应快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、设备要求低等特点。