Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白在毕赤酵母中共表达及免疫效果评价

为研究Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白在毕赤酵母中共表达及其免疫原性,本研究基于酵母细胞内表达载体pPICZA,利用独立编码三个衣壳蛋白表达盒构建质粒pPICZA-vp031,重组质粒经BglⅡ线性化后进行电转化,获得重组有三个独立表达盒重组酵母菌。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明衣壳蛋白均得到正确表达且具有良好抗原性。重组酵母菌经口服免疫小鼠后,机体能够产生血清特异性IgG抗体和黏膜sIgA抗体,淋巴细胞增殖结果显示免疫小鼠淋巴细胞特异性增殖指数显著高于灭活疫苗组,细胞因子检测结果显示经特异性抗原刺激免疫小鼠淋巴细胞分泌IL-4和IL-10与灭活疫苗组无显著差异,显著高于PBS对照组,表明重组菌能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答。本研究为口蹄疫基因工程疫苗研制奠定基础。     

重组鸡白细胞介素2的诱导表达与生物学活性测定

 将去除信号肽的鸡IL-2基因编码框克隆到原核表达载体pBAD/His B，实现了重组鸡IL-2(rchIL-2)蛋白在大肠杆菌中的高效表达。SDS-PAGE分析显示，表达蛋白的分子量约为18 kD。用rchIL-2为抗原制备了单克隆抗体和多克隆抗体，建立了检测rchIL-2含量的抗原捕获ELISA，探讨了天然chIL-2蛋白的体外表达动力学。非变性条件下纯化的rchIL-2 (0.4 ng) 对Con A活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性，而对鸭及鹅的T淋巴细胞无增殖活性。抗chIL-2多克隆抗体可完全中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白的生物学活性，而单克隆抗体无中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白生物学活性的功能。这些研究结果证实，大肠杆菌表达的rchIL-2及其多克隆抗体拥有生物学功能，而获得的单克隆抗体不具有chIL-2的中和特性。     

去铁胺对T淋巴细胞体外增殖、活化以及细胞周期的影响

分别采用MTT法、CFSE染色结合流式细胞术、双色荧光抗体染色结合流式细胞术、PI染色法检测去铁胺(DFO)对小鼠T淋巴细胞的药物毒性、对T淋巴细胞增殖、对Con A刺激下的小鼠T细胞CD69表达和淋巴细胞周期的影响。研究结果表明:DFO对淋巴细胞的毒性T细胞体外增殖、活化和细胞周期无影响;不同浓度的DFO(5、10、20、40μmol/L)能显著抑制受Con A刺激48 h和72 h后的T淋巴细胞增殖;低浓度的DFO(5、10μmol/L)对小鼠T淋巴细胞CD69的表达没有影响,高浓度(20、40μmol/L)的DFO可抑制T淋巴细胞CD69的表达;Ph能将T淋巴细胞抑制在G0/G1期。说明DFO除可通过抑制T淋巴细胞活化外,可能还通过其他机制抑制T淋巴细胞增殖,且DFO可以将淋巴细胞周期抑制在G0/G1期,可望发展成为一种新的免疫抑制干预药物。     

雏鸡免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株和毒株的细胞免疫反应

AA肉鸡雏鸡分别经口免疫柔嫩艾美耳球虫毒株早熟株，用免疫组化ABC法染色检测小肠、盲肠扁桃体、脾脏中CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞动态变化；用淋巴细胞转化实验MTT法检测T淋巴细胞活性。结果表明：球虫免疫鸡后，CD4^ T淋巴细胞在一次免疫后迅速增殖，第6天达到第一峰，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到38％和44％，免疫早熟株的鸡盲肠与脾脏中CD4^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和43％，而二次免疫后和对照相比很少有显著差异。CD8^ T淋巴细胞在一次免疫后比CD4^ T增殖速度慢，第9天达到第一峰。免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和47％，免疫早熟株的鸡在此日盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到36％和48％，二次免疫后迅速大量增殖，免疫柔嫩艾美耳球虫毒株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到39％和50％．免疫柔嫩艾美耳球虫早熟株的鸡在二免后第2天盲肠与脾脏中CD8^ T淋巴细胞占所有淋巴细胞百分率分别达到37％和50％。且CD8^ T淋巴细胞总体水平比CD4^ T淋巴细胞多。盲肠扁桃体中T细胞的增殖速度比其他组织更快。免疫早熟株的鸡与免疫毒株的鸡肠道黏膜中的CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞变化基本一致。一次免疫鸡比未免疫对照T淋巴细胞活性显著升高；进行二免的鸡免疫后第一、二、三周T淋巴细胞活性均比未进行二免的鸡显著升高；毒株免疫鸡T淋巴细胞活性大多与早熟株免疫鸡无8显著差异。     

Luman-N-端融合蛋白的表达、纯化及小鼠免疫效果评价

Luman-N-端基因转化菌BL21在IPTG的诱导下,用SDS-PAGE检测表达情况,经电洗脱法纯化,利用纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,通过间接ELISA和淋巴细胞增殖转化试验评价免疫效果。结果显示:细菌经IPTG诱导后在56 kD处,出现了特异性蛋白条带,与预计融合蛋白大小一致,融合蛋白经电洗脱纯化后免疫小鼠,间接ELISA显示抗体效价达到1∶4000,淋巴细胞增殖试验表明与空白组相比,Luman-N-端融合蛋白质量浓度为10、20、40和60μg/mL时,能显著刺激淋巴细胞的增殖(P<0.05);质量浓度为80、100μg/mL能极显著地刺激淋巴细胞的增殖(P<0.01)。     

猪流行性腹泻病毒S1-NTD蛋白表达及其免疫原性研究

【目的】在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1-NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。【方法】PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD。将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度。在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5 d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况。将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况。【结果】PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD。利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDV S1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高。在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P0.05)。【结论】成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性。     

小花棘豆生物碱对小白鼠T淋巴细胞增殖性反应的影响

本试验旨在研究不同剂量的苦马豆素(SW)、黄花碱(Ts)及其2类生物碱的混合物胃内灌服小白鼠,检测血液中T淋巴细胞的增殖性反应。将240只小白鼠随机分组,分别灌服不同浓度的SW、Ts和两类生物碱的混合物,并于试验的第7、14、21、28、35d每组随机抽取4只小白鼠,眼球采抗凝血,分离淋巴细胞,用Con A刺激,MTT法检测T淋巴细胞增值性反应情况。结果显示,低剂量的SW能够提高T淋巴细胞增殖,而中等剂量和高剂量短时间内对T淋巴细胞的增殖也有促进作用,长时间会严重的抑制T淋巴细胞的增殖;低剂量的Ts对T淋巴细胞的增殖几乎无影响,高剂量也会抑制T淋巴细胞的增殖;混合物出现了与SW类似的结果。结果表明,不同浓度的SW、Ts及其混合物均能不同程度的影响T淋巴细胞的增值性反应。     

IL-15基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

为弄清犬白介素-15(cIL-15)能否增强犬细小病毒VP2DNA疫苗的免疫原性,本研究首先通过RT-PCR方法从犬脾脏淋巴细胞中扩增全长cIL-15cDNA基因,并构建其与Myc-His-tag融合和非融合的表达载体:pcDNA-cIL-15/MH和pcDNA-cIL-15。将pcDNA-cIL-15/MH载体转染HEK293T细胞,确定构建的表达载体能否介导cIL-15进行分泌表达。利用过去构建的VP2表达载体和pcDNA-cIL-15载体共免疫小鼠,用ELISA检测免疫后小鼠血清中的抗体滴度,并用MTT检测小鼠淋巴细胞的增殖活性和用ELISA测定淋巴细胞干扰素-γ和IL-4的表达。结果显示,构建的cIL-15表达载体能够介导cIL-15在真核细胞中的分泌表达。用VP2和cIL-15表达载体共免疫小鼠,抗体水平明显高于VP2载体单免疫组(P0.01)。当免疫35d时,共免疫组淋巴细胞的刺激指数、干扰素-γ和IL-4的表达水平均明显高于VP2载体单免疫组(P0.05)。结果表明,cIL-15可明显增强VP2DNA疫苗的免疫原性。     

新疆巴什拜羊ISG15基因的克隆表达及活性检测

克隆表达新疆巴什拜羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。利用RT-PCR和RACE技术克隆了巴什拜羊ISG15基因的cDNA全长序列,将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的巴什拜羊ISG15基因cDNA全长为646 bp,开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33 ku,表达的蛋白可用Ni2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。     

利用流式细胞术分析活化T淋巴细胞特性

用多克隆刺激剂PMA和离子霉素体外刺激小鼠脾脏细胞4 h后,检测T淋巴细胞膜表面CD 69分子的表达;用P I标记分析细胞内DNA含量的变化;阻断细胞因子分泌后,检测不同亚群T淋巴细胞内细胞因子的表达。利用CFSE标记细胞,刺激44 h后,检测T淋巴细胞的分裂情况。结果表明：刺激4 h后,绝大多数T淋巴细胞表面表达CD 69抗原。细胞周期分析结果也表明,S＋G2/M期细胞数量明显增多,G1期细胞数量减少。通过固定、破膜、标记等处理后,分别表达IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-12的T淋巴细胞均有不同程度的提高。另外,刺激44 h后,明显检测到T淋巴细胞的分裂。以上结果说明,利用流式细胞术可以从不同的角度检测活化T淋巴细胞的活性。     

苦马豆素对小鼠细胞免疫功能的影响

【目的】探索苦马豆素(SW)对小鼠免疫器官发育、外周血液中细胞数及淋巴细胞增殖功能的影响,为SW免疫研究提供新的试验依据。【方法】将80只昆白系小鼠随机分为8组,其中5个试验组按0.05,0.2,0.8,3.2和6.4 mg/kg剂量每天灌服不同质量浓度的SW生理盐水溶液,连续21 d;其他3组均为对照组(分别为生理盐水组、环磷酰胺组和空白对照组)。检测小鼠胸腺和脾脏指数,用细胞分析仪检测外周血液中白细胞、红细胞及淋巴细胞数;用MTT法检测脾脏淋巴细胞的增殖活化。【结果】在SW剂量为0.2~0.8 mg/kg,小鼠脏器(胸腺和脾脏)指数及外周血液中的细胞数均增加;SW单独作用或其协同刀豆蛋白A(ConA)和植物血凝素P(PHA-P)刺激时,小鼠脾脏淋巴细胞的增殖活性增强,SW协同脂多糖(LPS)刺激时,小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性降低。SW剂量为6.4mg/kg时,小鼠的脏器指数和外周血液中的细胞数均减少;无论小鼠脾脏淋巴细胞受丝裂原刺激与否,小鼠脾脏淋巴细胞的增殖活性均降低。【结论】SW可以通过提高小鼠脏器指数及外周血液中细胞数提高淋巴细胞的增殖活性,增强小鼠的细胞免疫功能;SW剂量为6.4 mg/kg对小鼠细胞免疫功能有抑制作用,提示SW对小鼠细胞免疫功能的影响具有选择性和双向调节作用。     

γ-干扰素对弓形虫MIC3的基因免疫效果研究

将编码弓形虫微线蛋白3(MIC3)的真核表达质粒pcMIC3和编码γ-干扰素(IFN-γ)的真核表达质粒pcIFN-γ各100μg混合肌肉注射,间隔2周、3次免疫Balb/c小鼠,同时设相同剂量的pcMIC3、pcDNA和PBS免疫对照组。分别以酶联免疫吸附试验(ELISA)、四氮甲唑蓝(MTT)比色法和乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测试验小鼠血清的特异性抗体、脾淋巴细胞的增殖应答和细胞毒性T细胞(CTL)活性,并观察腹腔接种弓形虫RH株速殖子后质粒的免疫保护效果。结果表明:与其它试验组相比,pcMIC3 pcIFN-γ组试验小鼠在免疫8周后的ELISA抗体水平、脾淋巴细胞的增殖应答和CTL活性显著或极显著提高,免疫小鼠45 d时的生存率为100%,能有效抵抗小剂量弓形虫强毒株的攻击。     

增殖细胞核抗原在大肠肿瘤中的表达及其意义

研究增殖细胞核抗原在大肠腺瘤和大肠癌中的表达以及在不同程度不典型的增生中的表达，ＰＣＮＡ对良，恶性肿瘤鉴别的价值。对２５例大肠癌，３４例大肠腺瘤及１５例正常大肠粘膜组织，用手术和活检标本石腊切片，免疫组化染色，以单抗ＰＣ１０检测ＰＣＮＡ表达。     

表达PEDV S蛋白重组仙台病毒的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV) S蛋白的重组仙台病毒(SeV),并评价其诱导的特异性免疫应答反应,利用PCR扩增得到PEDV中国流行株的全长S基因,构建含S基因的重组仙台病毒感染性克隆质粒(pBeloBAC-SeV-PEDV-S),并拯救重组病毒SeV-PEDV-S。对重组病毒进行鉴定并测定其生长曲线以确定成功获得表达PEDV S蛋白的重组仙台病毒。将表达S蛋白的仙台病毒免疫小鼠;间接免疫荧光和Western blot试验检测血清中特异性抗体的产生;利用脾脏淋巴细胞分离和流式细胞技术检测特异性T淋巴细胞增殖反应;对血清中的中和抗体效价进行评价。结果表明：重组仙台病毒能特异性表达PEDV S蛋白,且与野生型仙台病毒有一致的生长曲线;免疫小鼠后,重组仙台病毒能有效刺激小鼠产生特异性抗体,诱导较高的中和抗体水平,且能显著促进PEDV特异性T淋巴细胞增殖。综上,该试验为进一步研究重组仙台病毒在猪体上的免疫反应奠定了基础,也为新一代安全有效的PEDV活载体疫苗的研发提供了策略。     

转基因猪外源hDAF基因表达产物的功能研究

应用微量淋巴细胞毒方法对转ｈＤＡＦ基因猪外源基因表达产物的功能进行了初步研究。结果表明：外源ＨＤＡＦ基因在猪淋巴细胞上的表达产物具有生物学功能，活细胞数与总细胞数之比最高者达４４．４４％，从而为转ｈＤＡＦ基因猪的检测提供了一个新方法。     

猪圆环病毒Ⅱ型和巨噬细胞对体外培养仔猪淋巴细胞白介素-6和白介素-10及其受体表达的影响

选取5头猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体阴性的普通断奶仔猪,无菌取其脾脏制成单细胞悬液后,分设淋巴细胞(L组)、淋巴细胞+PCV2(L+V组)、淋巴细胞+巨噬细胞(L+M组)和淋巴细胞+巨噬细胞+PCV2(L+M+V组)4组进行体外培养。分别在培养后0 h、6 h、12 h和24 h收获淋巴细胞及其上清液。用ELISA检测上清液中猪淋巴细胞白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)的含量,用RT-PCR检测淋巴细胞中IL-6、IL-6R、IL-10和IL-10RmRNA的表达。结果显示:与L组相比,L+V组中IL-6的含量在攻毒后24 h显著升高(P0.05);PCV2在攻毒后12 h对IL-6RmRNA的表达呈显著抑制(P0.05);PCV2在攻毒后6 h显著促进IL-10的表达(P0.05)。上述结果表明,PCV2能促进淋巴细胞中IL-6和IL-10的表达;而巨噬细胞能抑制PCV2对淋巴细胞中IL-6表达的上调作用,同时协同PCV2促进淋巴细胞中IL-10及其受体持续性高表达,导致持续的免疫抑制,在PCV2的致病过程中扮演重要角色。     

地塞米松对特发性血小板减少性紫癜外周血淋巴细胞凋亡及Fas/FasL的影响

目的 :观察地塞米松对特发性血小板减少性紫癜 (ITP)外周血淋巴细胞凋亡及 Fas、Fas L表达的影响及其临床意义。方法 :用流式细胞仪检测 30例 ITP患儿治疗前后外周血淋巴细胞凋亡率及 Fas、Fas L蛋白表达。结果 :治疗前淋巴细胞凋亡率及 Fas、Fas L蛋白表达与对照组相比差异无统计学意义 (P>0 .0 5)。治疗后血小板增加时淋巴细胞凋亡率增加 ,Fas、Fas L蛋白表达上调 ,与治疗前相比差异有显著性意义 (P<0 .0 1 )。结论 :地塞米松可显著促进 ITP患儿外周血淋巴细胞的凋亡 ,上调淋巴细胞 Fas、Fas L的表达 ,有助于清除激活的淋巴细胞。     

伏马毒素B_1对猪肾上皮细胞增殖的影响

研究旨在探究伏马毒素B_1(FB_1)对猪肾上皮细胞增殖的影响,通过MTT检测FB1对PK15细胞活力和qPCR检测周期相关基因的mRNA表达水平。结果表明,FB1显著减少细胞活力,降低细胞核增殖抗原PCNA和周期蛋白Cyclin B和Cyclin D的mRNA表达水平,升高P21和P27的mRNA表达水平。说明FB1可通过调控细胞周期相关基因的表达抑制猪肾上皮细胞增殖。     

棉酚对多浪羊淋巴细胞凋亡及其对核酸降解的研究

 主要通过使用RPMI 1640培养基培养淋巴细胞、瑞氏—吉姆萨染色、DNA和RNA电泳等方法来研究棉酚对多浪羊淋巴细胞的凋亡效应和对淋巴细胞核酸影响。研究结果表明,经瑞氏—吉姆萨染色4h淋巴细胞出现凋亡小体;DNA和RNA通过琼脂糖凝胶电泳检测在4h分别出现梯状条带和18S降解。可见,当细胞培养液中棉酚浓度为1.35μmol/L,培养淋巴细胞4h后,可抑制多浪羊淋巴细胞的增殖,并且促进凋亡及其核酸的降解。     

鸭viperin基因的克隆、表达及Viperin蛋白的抗病毒活性

Viperin蛋白是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,广泛存在于各类动物体内,在进化上高度保守。本研究以鸭外周血淋巴细胞为原材料,通过RT-PCR扩增得到viperin基因,同时构建真核表达质粒p EGFP-N1-viperin,转染至DF-1细胞,用坦布苏病毒攻击后,检测该病毒在转染质粒组和转染空载体组细胞中的增殖情况。结果表明,鸭viperin基因开放阅读框为1 092 bp,编码蛋白由363个氨基酸构成。转染结果显示,viperin基因在DF-1细胞中成功表达。坦布苏病毒攻击后,与转染空载体组相比,转染p EGFP-N1-viperin组显著抑制了坦布苏病毒在DF-1细胞中的增殖。说明鸭Viperin蛋白作为抗病毒蛋白,具有良好的抑制坦布苏病毒增殖的作用。本试验结果为鸭Viperin蛋白抗病毒生物学功能的进一步研究奠定了良好基础。