叶用莴苣TRAP 反应体系的建立

以叶用莴苣为试材,采用正交设计和单因素试验2种方法研究叶用莴苣TRAP反应体系中Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物等4个因素的浓度变化对扩增结果的影响,建立最佳反应体系。结果表明：TRAP-PCR反应最优体系是在20μL反应体系中含DNA模板60～100 ng、10×PCR buffer（Mg^2＋free）2μL、Mg^2＋终浓度2.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶含量1.0 U、dNTPs终浓度0.2 mmol/L、引物终浓度0.75μmol/L。该体系对叶用莴苣种质的扩增结果稳定,条带清晰度高且多态性丰富,可用于对叶用莴苣种质资源的遗传多样性分析和亲缘关系鉴定。     

枣树RAPD分析体系优化研究

利用随机引物扩增多态性(RAPD)分子标记技术研究不同枣树品系之间遗传多态性,建立起一个基于PCR技术的分子遗传标记RAPD分析的优化体系.设置不同的浓度梯度,从dNTPs、随机引物、Taq酶、Mg2 、缓冲液Buffe,的浓度及模板DNA的质量和用量方面考察,建立了枣树RAPD技术最优体系.结果表明:20μL反应体系组分含量为10×Taq酶Buffer 2μL,Mg2 浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度200μmol/L,引物浓度0.2 μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度0.06 U/μL,DNA模板浓度1.5 ng/μL.最佳扩增程序为94℃预变性4 min,94℃变性30 s,36℃退火40 s,72℃延伸1min,50个循环,最后72℃延伸8 min.     

枇杷ISSR扩增反应体系的优化

采用正交设计对影响枇杷ISSR-PCR的模板DNA、dNTPs、Primer、Taq酶及Buffer(含Mg2+)进行优化。试验结果表明:20μL反应体系中,含模板DNA5ng、dNTPs0.25mmol/L、Primer0.25μmol/L、Taq酶0.5U和10×Buffer(含Mg2+)3μL。此外,从95条ISSR引物中筛选出11条具有丰富的多态性位点的引物,同时优化各引物退火温度。     

油葵SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为了获得适合油葵的SSR-PCR反应体系,通过采用控制变量法对影响SSR反应体系的主要因素进行优化,研究Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等因素。结果表明各因素的终浓度分别在Mg²⁺浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq酶量0.5 U、引物浓度0.4 μmol/L及退火温度为53.9℃时最为适合。通过试验优化后的体系筛选引物,最终从50对引物筛得19对多态性好的引物可进行下一步的研究。     

西番莲科龙珠果ISSR-PCR体系的建立和优化

为了获得适于龙珠果ISSR-PCR的反应体系,本研究以龙珠果叶片为试验材料,提取基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响龙珠果ISSR-PCR扩增结果的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA量进行优化,并筛选了最适退火温度。试验结果分析表明,各因素影响显著性为dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶用量>Mg²⁺浓度>模板DNA量>引物浓度。在20μL反应体系中,dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg²⁺浓度2.0 mmol/L、模板DNA 25 ng、引物浓度0.4μmol/L为最佳用量。实验从100条UBC引物中筛选得到22条多态性较好的引物。本研究为龙珠果ISSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。     

正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

药用植物刺山柑ISSR-PCR遗传体系的建立和优化

对药用植物刺山柑遗传多样性研究分析,建立了刺山柑ISSR-PCR稳定的反应体系,利用植物基因组试剂盒提取刺山柑药材DNA;根据此引物采用正交实验设计考察影响PCR扩增的4个主要因素,筛选出最佳反应条件:25μL ISSR-PCR的最佳浓度为10×buffer 2.5μL、引物0.2μmol/L、模板40 ng/μL、dNTPs 0.4 mmol/L、Taq/DNA聚合酶0.5 U,利用梯度筛选获得U 808引物最佳退火温度。为利用这一分子标记对药用植物刺山柑进行遗传多样性分析奠定了基础。     

珍稀植物浙江雪胆SCoT-PCR体系的建立及优化

为建立浙江雪胆SCoT-PCR的最佳反应体系,本研究采用正交实验对dNTPs、引物、模板DNA及Taq聚合酶等的浓度进行筛选,并对采自景宁畲族自治县的材料进行验证。结果表明,PCR体系中各因素用量对多态性结果的影响大小依次是引物>dNTPs=Taq酶>模板DNA,最佳反应体系(20μL)为0.7μL dNTPs(10 mmol/L),0.3μL引物(20μmol/L),0.4μL Taq酶(2 U/μL),1.2μL DNA模板(20 ng/μL),2μL 10×缓冲液(含20 mmol/L Mg²⁺),dd H₂O 15.4μL;筛选出11条稳定性好、多态性高和重复性好的引物,同时优化了它们的最佳退火温度;对10份种质资源进行验证,结果表明该体系扩增的结果稳定、扩增条带清晰。浙江雪胆SCoT-PCR体系的建立和优化,为后续开展遗传多样性研究、资源保护和分子育种提供了依据。     

大豆SSR技术反应体系的优化

以大豆为材料,研究了PCR反应体系的主要成分模板DNA浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq酶浓度及退火温度对大豆SSR扩增结果的影响,探索影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量及引物的退火温度。结果表明:在试验设计范围内,DNA浓度和dNTP浓度对扩增影响较大,引物浓度在0.05~0.2μmol/L范围内对扩增影响较小,Taq酶浓度对扩增有一定影响,引物要有其扩增适宜的退火温度。确立了适合大豆SSR分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20μL,模板DNA 20 ng,dNTP 200μmol/L,引物0.15μmol/L,Taq酶0.5 U,10×Taq Buffer 1.5 mmol/L,ddH2O补至20μL。     

油菜黑胫病菌 ISSR-PCR 反应体系优化

通过正交试验设计,对油菜黑胫病菌ISSR-PCR 反应体系的各影响因素进行研究,即从 Taq 酶、Mg2＋、dNTPs、引物以及模板浓度5因素4水平进行优化,筛选并建立了适合油菜黑胫病菌ISSR分子标记的最佳反应体系,即在25μL反应体系中包含Taq DNA酶1 U,Mg2＋2．0 mmol/L,dNTPs 0．2 mmol/L,引物0．6μmol/L,模板40 ng以及2．5μL 10×Buffer。并以扩增条带丰富、清晰、稳定性强为原则,从所查找的110条引物中筛选出24条适于油菜黑胫病菌ISSR-PCR扩增的引物,同时对各引物的最佳退火温度进行了筛选确定,经对20株病原菌的稳定性检测,证实该优化体系可用于研究该病原菌的遗传多样性。     

鸭梨苹果茎痘病毒外壳蛋白基因克隆及原核表达

为了进一步明确苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)的分子变异及株系分化,制备相应特异性抗血清.本研究以库尔勒地区种植的感染ASPV的鸭梨(Y)枝条韧皮部为试材,采用RT-PCR技术扩增ASPV CP基因,克隆、测序,获得了鸭梨分离物外壳蛋白(ASVP CP-Y)基因,将该CP基因连...     

天然棕色棉查尔酮合成酶基因(GhCHS1)的克隆和实时定量表达分析

根据植物查尔酮合成酶基因保守区序列设计引物,以发育18d的天然棕色棉纤维为材料,用RT-PCR结合RACE技术分离得到了一个查尔酮合成酶基因的全长cDNA(GenBank登录号:EU921263),将该基因命名为GhCHS1。实时荧光定量PCR检测显示,GhCHS1基因在棕色棉纤维细胞中优先表达,且在棕色棉纤维中的表达量远高于其近等基因系白色棉,但是该基因在绿色棉中几乎检测不到。这些试验结果暗示,该基因可能在棕色棉纤维色素形成中发挥重要作用。     

甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因(SPS3-1)的克隆与序列分析

以甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因(SPSⅢ-2,NCB1登录号为EU278617) cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证分离了甜高粱蔗糖磷酸合成酶基因组DNA序列(SPS3-1,GeneBank登录号为FJ750250).该序列全长6 325 by,包含13个...     

一种利用流式细胞术鉴定梨倍性的方法

流式细胞术鉴定植物染色体倍性的方法广泛应用于果树多倍体育种中,然而相关流式细胞术鉴定梨染色体倍性的方法还没有系统的研究。以梨树叶片为试材系统优化了各个流式细胞术关键实验节点,结果表明：实验材料选取当年春季新梢第3~5 片梨树嫩叶,尤其是大棚新梢嫩叶最好;叶片前处理时用蒸馏水、去离子水依次洗净叶片表面后,再用去离子水浸泡10 min;使用WPB解离液对梨叶片细胞核进行提取后,用500 目滤膜过滤2 次,离心1 次后用流式细胞仪进行检测可得到理想的实验结果。该方法步骤简单、结果可靠,是一种快速、高效的梨染色体倍性鉴定的方法,可广泛用于梨树多倍体鉴定。     

猪FcRn基因及其剪接变体序列的克隆与序列

【研究目的】克隆并分析猪FcRn基因;【方法】十二指肠组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化JM109感受态细胞,筛选阳性克隆并测序;【结果】FcRn阳性克隆两条序列在NCBI上比较,显示序列同猪FcRn（AY740682.1）同源性都为99 %。【结论】克隆了猪FcRn基因的序列和其剪接变体序列,其剪接变体序列已在GenBank 上注册（Accession.EU852582）     

库尔勒香梨部分果实性状遗传的研究

库尔勒香梨是中国久负盛名的梨果佳品。却存在着果个小、果心大的缺陷。为了传承香梨品质优势,克服其弱点,本课题组于1971年开始香梨为亲本的杂交育种工作。以6个梨的杂交组合、351株实生树为试材,进行了各组合亲本和后代的性状分析,探讨了各主要性状的遗传趋势。结果表明,杂交后代果实形状、肉质遗传倾向于亲本,倾亲率分别为68.09%和51.38%。梨果实大小为数量性状,杂种后代果个分离广泛,杂种后代果实普遍变小,各组合的遗传传递力在68.91%~117.51%之间,平均遗传传递力为93.11%。梨果实可溶性固形物含量呈数量性状遗传,杂种后代分离较广,其组合传递力平均为97.49%。     

红花檵木CHS基因的克隆与序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第1个关键酶。根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物,以红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)大叶红的嫩叶为材料,用RT-PCR方法,分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA（GenBank登录号为JQ609678）,将该基因命名为LcvrCHS1。该序列长927 bp,编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%,与其他科植物（绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、领春木属）CHS序列同源性也达到80%以上;其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达98%。     

小麦抗叶锈病基因Lr35的RGA分析

根据已知植物抗病基因的NBS,LRR等保守结构域设计引物,对小麦全套抗叶锈病近等基因系材料进行RGA分析。引物对Pto-kin1IN／XLRR-INV1从近等基因系TeLr35中扩增获得一条747bp的特异性片段。序列分析表明,该片段与小麦基因片段Triticum urartu clone BAC 210J24,Triticum monococcum DV92的BAC克隆231A16等具有较高同源性,为Lr35的克隆奠定了基础。     

中国水仙八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的克隆及表达分析

八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是影响类胡萝卜素合成的一个重要限速酶,在植物花色发育过程中起着重要作用。采用RT-PCR技术从中国水仙（Narcissustazetta var.chinensis）幼嫩花蕾中分离到一个新的水仙花色发育相关的PDS基因,命名为NTPDS1（GenBank登记号：EU138883）。该基因长1719bp,具有一个1713bp的完整开放读码框（ORF）,编码570个氨基酸。序列分析表明,NTPDS1编码的氨基酸序列与其它植物的PDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,NTPDS1与喇叭水仙亲缘关系最近。利用半定量PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在中国水仙的花、叶片和根中均有表达,但以花器官中表达量最高;在花瓣和副冠中的表达量高于雄蕊和雌蕊。     

库尔勒香梨腐烂病拮抗菌的筛选及其防效测定

筛选对梨腐烂病菌具有抑菌活性的拮抗细菌,明确其防病效果,为香梨树腐烂病的生物防治提供依据。从各种原料的果蔬酵素液和香梨枝条组织中分离细菌,采用平板对峙培养初筛和细菌发酵液复筛,测定分离菌株对香梨腐烂病菌(Valsa ceratosperma)的抑菌活性,从中筛选抑菌作用显著的拮抗菌株,通过离体枝条法测定其防病效果。筛选出对V. ceratosperma具有抑菌活性的12个细菌菌株,抑菌率为54.72%~86.43%。离体枝条法测定结果表明,分离自酵素液的拮抗细菌XG-FX22和G-FX12菌株的保护性防效分别达到了77.71%和65.29%,治疗性防效分别达到了66.71%和66.14%,防病效果显著高于其他菌株。通过形态学及16S rDNA序列分析,将G-FX12和XG-FX22菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。研究结果为香梨腐烂病生防资源的发掘和病害的有效防控提供科学基础。