结缕草农杆菌介导遗传转化中辅助处理方法的改良

以结缕草愈伤组织为试材,利用农杆菌介导法时包括辐照、愈伤组织状态、共培养条件及负压处理等辅助处理方法对愈伤组织瞬间表达频率的影响进行研究。结果表日日：2Gy的辐照剂量利于提高瞬间表达频率;1-2个月的愈伤组织适于转化;全光照的共培养条件下瞬间表达频率高于16／8h光照培养和暗培养条件下瞬间表达频率;农杆菌与愈伤组织混合培养时给予适当的负压条件可提高愈伤组织瞬间表达频率和存活率。     

宁夏水稻农杆菌转化组培体系的建立

高效的组培再生体系是水稻农杆茵遗传转化的基础,以宁夏4个主栽水稻品种为受体材料,对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的几个主要因素进行了研究,结果表明:花药和幼胚的愈伤组织诱导率高于成熟胚,而且愈伤状态好,有利于转化;在共培养基上铺上1张灭菌滤纸共培养时,农杆茵在培养基及受体材料表面上不会过度生长.共培养条件以26℃,共培养2天的抗性愈伤频率最高;共培养后不经洗茵处理直接进行筛选的抗性愈伤频率高于洗茵处理;经过预分化培养可提高分化率;干燥处理不仅可以有效杀死农杆茵,而且可以改善愈伤组织状态,提高转化率.初步建立了宁夏几个主栽品种的农杆菌转化体系.     

辐照对高羊茅愈伤组织诱导及农杆菌介导转化的影响

以高羊茅成熟种子及产生的愈伤组织为试验材料，研究了辐照对愈伤组织诱导和农杆菌介导转化的影响。结果表明，5—20Gy辐照对高羊茅成熟种子诱导愈伤组织有一定的促进作用，使出愈率比对照提高4．7％-12．3％，其中以10Gy处理的效果最好，剂量超过30Gy对愈伤组织形成产生抑制作用。其转化前，愈伤组织被1-4Gy的剂量辐照处理，其GUS瞬间表达率随剂量的增加逐渐提高，但当剂量高于4Gy时，愈伤组织的GUS瞬间表达率随剂量的增加而下降。综合考虑辐照后愈伤组织的存活率和GUS瞬间表达率，2Gy为高羊茅愈伤组织转化的最佳剂量。深入观察表明，辐照后继代培养24h最适合农杆菌介导感染。     

农杆菌介导水稻sbeⅡb基因转化体系的建立

本文对水稻愈伤组织再生体系及其转化影响因子进行了研究.以水稻品种秀水11的幼胚和成熟胚为外植体,以M S+肌醇0.1g/L+2,4-D 2mg/L+6-BA 0.2mg/L+脯胺酸2.8g/L+水解酪蛋白0.3g/L作诱导培养基,愈伤组织诱导率最高为73.45%,愈伤组织在M S+6-BA2 mg/L+NAA 0.5mg/L的分化培养基上,分化频率达53.33%;在此基础上对农杆菌介导水稻愈伤组织转化的因子进行了优化,获得较高转化频率的条件为:预培养时间3d,在OD600值为0.6农杆菌菌液中感染10min,共培养3d.     

农杆菌介导小麦遗传转化方法的优化与应用

为了优化农杆菌介导小麦遗传转化方法,以郑麦9023幼胚愈伤组织为材料,研究了60Coγ射线辐照对农杆菌介导法遗传转化的影响。结果表明,在辐照剂量为4 Gy,辐照处理后以继代培养24 h时β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因瞬时表达率最高。负压抽拉处理结果表明,抽拉10次可明显提高农杆菌介导的遗传转化效率。转基因抗性再生植株bar基因分子标记检测结果表明,利用改良的遗传转化处理方法(4 Gy辐照+辐照后培养24 h+负压抽拉处理10次),可将遗传转化效率由2.2%提高至3.5%,优化后的小麦农杆菌转化方法可应用于小麦遗传转化。     

农杆菌介导水稻sbeIIb基因转化体系的建立

本文对水稻愈伤组织再生体系及其转化影响因子进行了研究。以水稻品种秀水11的幼胚和成熟胚为外植体,以M S 肌醇0.1g/L 2,4-D 2mg/L 6-BA 0.2mg/L 脯胺酸2.8g/L 水解酪蛋白0.3g/L作诱导培养基,愈伤组织诱导率最高为73.45%,愈伤组织在M S 6-BA2 mg/L NAA 0.5mg/L的分化培养基上,分化频率达53.33%;在此基础上对农杆菌介导水稻愈伤组织转化的因子进行了优化,获得较高转化频率的条件为:预培养时间3d,在OD600值为0.6农杆菌菌液中感染10m in,共培养3d。     

农杆菌介导的AtMYB118基因转化橡胶树易碎胚性愈伤组织体系优化

[目的]采用正交设计L25(56)优化农杆菌介导的AtMYB118基因对橡胶树易碎胚性愈伤组织的遗传转化体系,为橡胶树品种遗传改良提供参考.[方法]以75.0 mg/L卡那霉素筛选经过转化的愈伤组织;采用GUS瞬时表达检测方法评价6个因素即预培养时间、农杆菌菌液浓度(OD600)、乙酰丁香酮(AS)浓度、侵染时间、共培养温度和共培养时间对遗传转化的影响.[结果]6个因素显著影响橡胶树长期培养的易碎胚性愈伤组织的转化频率,易碎胚性愈伤组织遗传转化优化条件为:预培养0d,菌液OD600为0.7,侵染时间7 min,共培养时间5d,AS 200 μmol/L,共培养温度25℃.在此优化条件下可获得最高转化频率.经过4~6个月的筛选,获得17个GUS染色阳性的易碎愈伤组织系.经PCR和反转录PCR分析转化愈伤组织,进一步证实uidA、nptⅡ、AtMYB118基因已被整合到愈伤组织基因组中并表达.培养获得1539个胚状体,其中164个为转基因胚状体,转化频率为10.6%;最终获得4株转AtMYB118基因植株.[结论]优化获得可行有效的橡胶树易碎胚性愈伤组织遗传转化体系,可为其品种遗传改良提供技术支持.     

用根癌农杆菌介导获得籼稻转基因植株

用携带p13W4质粒的根癌农杆菌EHA105感染籼稻龙特甫品种的幼胚愈伤组织，经共培养并在潮霉素25－50mg/L浓度条件下筛选2－3次，获得了对潮霉素表现抗性的愈伤组织，其愈伤组织转化频率为25.3%,将抗性愈伤组织转入分3化培养基培养形成植株，经GUS活性测定和PCR检测，结果证明外源基因确已导入这些转基因植株之中。     

根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系的研究

[目的]对新疆推广种植的水稻品种进行组织培养,探索适合新疆水稻品种的遗传转化条件,为新疆水稻的遗传改良工作奠定基础.[方法]以新疆3个水稻品种成熟胚诱导的良好胚性愈伤组织为受体,以SiPEBP为目的基因,应用农杆菌介导法对水稻进行遗传转化,同时以抗性愈伤率为依据,对影响转化的愈伤诱导率、农杆菌侵染浓度、时间和共培时间进行优化研究.[结果]在NB培养基中添加2 mg/L的2,4-D的愈伤诱导率高;相比25℃、暗培养,28℃、持续光照培养可使诱导率提高到100;,且缩短了诱导周期;在OD600值为0.3的农杆菌菌液浓度,侵染愈伤30 min,共培养2d,同时添加一张无菌滤纸,有利于提高转化效率;通过培养条件的优化,3个水稻品种的抗性愈伤率均达到40;以上.[结论]新疆水稻农杆菌转化的几个主要因素,建立了农杆菌转化体系.     

借助粒子轰击提高农杆菌转化水稻的频率

为了提高农杆菌转化水稻的频率，对粳稻品种台北309的幼穗和成熟胚的愈伤组织诱导频率和粒子轰击时其愈伤组织转化频率的影响进行了研究。结果表明，水稻幼穗是诱导愈伤组织的最佳外植体，通过粒子轰击可以有效地提高农杆菌转化水稻愈伤组织的频率，其中以每个样品轰击两次的效果最好，其转化率比对照提高54．5％。     

农杆菌介导的明恢63转化体系的建立

本试验优化了籼稻的农杆菌遗传转化系统,并以明恢63为材料进行了遗传转化.结果显示,从1 100块愈伤组织中获得133块抗性愈伤,其抗性愈伤率为12.7%,分化率为81.3%,所获取的转基因植株后代的分离绝大多数符合孟德尔遗传规律.因此,此系统是一个较好的农杆菌介导的遗传转化系统,可用于基因功能验证、新基因在后代的遗传方式及共转化培养marker-free转基因植株.     

以GFP为报告基因优化农杆菌介导海岛棉转基因体系的研究

为了进一步建立优化的根癌农杆菌介导海岛棉外源基因转化体系,提高海岛棉外源基因转化率。以生理状态基本一致的海岛棉新海30号的胚性愈伤组织为受体材料,以绿色荧光蛋白基因（GFP）为报告基因,将浸染时间和共培养时间作为试验要素,筛选适宜的浸染时间和共培养时间。结果表明,根癌农杆菌介导的海岛棉外源基因转化体系的最佳浸泡时间为15 min,共培养时间为24 h。     

中华猕猴桃华优遗传转化系统建立研究

为了更好的利用遗传转化技术进行猕猴桃品种改良研究,以中华猕猴桃华优组培苗幼嫩叶片为材料, 研究了外植体分化不定芽再生途径所需的培养条件及转化效率提高方法。结果表明,在叶片不定芽诱导培养基中加 入浓度为0.75~1.0 mg/L 的TDZ 时,叶片愈伤发生率达85.7%~90.1%,不定芽发生率达41.8%~44.6%;在TDZ 1.0 mg/L 基础上,补充0.1~0.4 mg/L IAA 可使叶片愈伤发生率提高到96.7%~100%,不定芽发生率提高到67.4%~71.9 %; 在农杆菌侵染液与共培养基中同时加入75~100 滋mol/L 浓度的AS,可使GUS 瞬时表达率及卡那抗性芽发生率分别 提高至27.9%、14.5%;外植体被农杆菌侵染前,的预培养2~3 d有利于提高GUS 表达率与卡那抗性芽发生率。GUS 染色与PCR 扩增检测结果显示,Shiva A基因已转化至中华猕猴桃华优转基因植株。     

农杆菌介导胡萝卜转化体系的诱导培养基优化

高频再生系统是外源基因成功转化的先决条件,但再生系统不等同于转化系统。为提高农杆菌共培养后胡萝卜的再生频率,以日本新黑田五寸参和林丰改良五寸参2个品种胡萝卜下胚轴为外植体,利用农杆菌介导法将人源白细胞介素-2基因(IL-2)导入其中,探讨了共培养后诱导培养基中激素浓度和筛选剂对再生的影响。结果显示:不同基因型胡萝卜的分化对激素浓度的反应不同,林丰改良五寸参在3种培养基上的胚性愈伤率差异不显著;日本新黑田五寸参胚性愈伤率和每个外植体分化的抗性株数随激素浓度的提高而呈上升趋势,2,4-D和6-BA浓度为1.0mg/L时胚性愈伤率和每个外植体分化的抗性株数最高,分别为87.50%和59株;日本新黑田五寸参以bar基因为标记基因、PPT作筛选剂时,分化较好。因此,遗传转化过程中,为提高共培养后胡萝卜胚状体的分化率,对共培养后的诱导培养基进行再优化是必要的。     

农杆菌介导的柳枝稷遗传转化体系的优化

【目的】为建立农杆菌介导的柳枝稷高效再生及遗传转化体系。【方法】试验以柳枝稷品种Alamo、Performer及Blackwell的成熟种子为外植体诱导愈伤组织。愈伤诱导6周后,借助解剖镜观察愈伤形态,去除愈伤组织外层含水量大、海绵状愈伤组织,挑选位于愈伤组织中心位置的核状、紧实型愈伤置于继代培养基培养。暗培养3周后,在解剖镜下挑选结构松脆、生长旺盛的愈伤组织按细胞系继代增殖培养。该类愈伤组织易于分化,属单子叶植物愈伤组织分类中的第Ⅱ型。经两次继代增殖培养后,可以获得足够的愈伤组织进行再生和遗传转化研究。为优化柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的农杆菌侵染流程,试验比较了3种农杆菌侵染流程下的转基因效率。真空和干燥处理（VD）：将装有愈伤组织及菌液的50 mL离心管置于真空泵中抽真空10 min（压力-0.8MPa）,28℃, 80 r/min慢摇20 min后弃菌液,将愈伤组织堆放于3层滤纸上干燥处理2 h,随后将愈伤组织转入含有500 μL无菌水的2层滤纸上进行共培养;冷处理加真空和干燥处理（CVD）：侵染前将愈伤组织置于3%麦芽糖、300 μmol·L^-1谷氨酰胺（Gln）溶液中冰浴20 min,然后依VD流程侵染,共培养阶段用MP培养基代替无菌水;渗透冷处理加真空和干燥处理（PVD）：用6%的麦芽糖溶液替代CVD中3%麦芽糖溶液。通过比较Gus染色及PCR阳性率来评价三种方法的转化效率。【结果】愈伤挑选方法不仅从柳枝稷低地型品种中挑选得到再生率达95%以上的Ⅱ型愈伤细胞系,也首次获得高地型品种Blackwell的Ⅱ型愈伤组织,分化率达50%。不同转化方法评价过程中发现,低地型品种AlamoⅡ型愈伤组织采用CVD农杆菌侵染流程转化效率最高,达72%,显著高于侵染流程VD（53%）和PVD（44%）。应用CVD转化法,Performer转化率达96%;首次成功进行了高地型品种Blackwell的遗传转化,转化效率为5.6%。【结论】本研究建立了借助解剖镜挑选柳枝稷易于再生的Ⅱ型愈伤组织的方法,该方法适用于柳枝稷不同生态型品种;农杆菌转化过程中采用CVD侵染流程可显著提高转基因效率。本研究首次报道了柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的挑选流程,建立了适合不同生态型柳枝稷的高效再生及遗传转化体系,首次获得高地型品种Blackwell的转基因植株,为柳枝稷遗传改良及其功能基因研究奠定基础。该方法也适用与其他难于再生的单子叶植物再生及遗传转化体系的建立。     

农杆菌介导的双SBE基因RNAi载体对水稻的遗传转化

[目的]提高水稻中直链淀粉的含量,扩大稻米的利用范围。[方法]以水稻中花11品种为材料,通过农杆菌介导法,侵染水稻幼胚诱导出的愈伤组织,将淀粉分支酶基因SBE1和SBE3同时导入受体愈伤组织,经过一系列的共培养、预分化、分化、生根壮苗后,获得含有转基因的转化植株,并对转化植株进行PCR鉴定。[结果]通过用根癌农杆菌介导法,侵染由水稻幼胚诱导的274粒愈伤组织,经过共培养、筛选,得到177粒抗性愈伤,然后将抗性愈伤预分化、分化得到103株分化苗,生根壮苗后获得49株转基因植株;从49株转基因植株中随机提取34株的基因组DNA,利用PCR技术从基因组DNA中扩增得到了片段大小约为500 bp的潮霉素基因序列。[结论]初步证实转基因植株的真实性,淀粉分支酶基因SBE1+SBE3成功整合进入水稻基因组中。     

Optimization of Transformation Efficiency of Suspension Cultured Vitis vinifera cv. Chardonnay Embryogenic Cells

Vitis vinifera cv. Chardonnay suspension cultures were established from proembryogenic mass and employed for optimizing Agrobacterium-mediated transformation system. One-factor-at-a-time experiment revealed that OD₆₀₀ of Agrobacterium, time of inoculation, co-cultivation, and cell-drying before inoculation significantly affected the transformation efficiency which reached maximum 21.5% at the following conditions: 0.8 of OD₆₀₀, 25 min of inoculation, 2 d of co-cultivation, and 10 min of cell drying. Response surface methodology experiments based on a five-level, four-factor central-composite rotatable design were then used to optimize these selected factors. The optimized conditions for Chardonnay grape transformation were: 0.8711 of OD₆₀₀, 28.9 min of inoculation, 2.25 d of co-cultivation and 11.76 min of cell drying. After optimization, transformation efficiency was 26.2% and there were no interactions among different factors.     

农杆菌介导北方粳稻转化体系的研究

通过农杆菌介导的方法将Bar-Bt基因（抗除草剂基因和抗虫基因构建在同一载体上的双基因）整合到北方优质粳稻龙稻6号、松粳9号等品种中;分别以供试品种的幼胚和成熟胚为外植体诱导愈伤组织,携带有Bar-Bt基因双元载体PCAMBIA1301号的根癌农杆菌EHA105为载体,GUS基因的瞬时表达率为衡量指标,对影响农杆菌介导的龙稻6号、松粳9号等品种的转化效率的主要因素进行了研究。结果表明：农杆菌侵染愈伤组织的菌液浓度以D（600nm）=0.8～1.0较为适宜,最佳共培养时间为2～3 d,预培养时间为5 d,共培养培养基中添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的转化效率有明显提高。     

根癌农杆菌介导茶树转基因体系的建立

利用茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]品种"农抗早"的叶片进行培养,诱导形成愈伤组织。选择生长旺盛、致密的愈伤组织块与根癌农杆菌EHA105进行共培养,通过潮霉素(Hygromycin)抗性筛选、GUS染色及PCR的验证,获得部分转基因愈伤组织。在添加100μmol·L-1的乙酰丁香酮(AS)处理后,转化率约为10%。同时试验结果证明,AS可以提高农杆菌的转化效率,增加渗透压却不能提高转化率。     

Study on Plant Regeneration of Wheat Mature Embryos Under Endosperm-Supported Culture

To reveal the suitability of using mature embryos as an explant source in wheat tissue culture, mature embryos from eight common wheat cultivars （Triticum aestivum L. cv.） were cultured with or without endosperm to test their efficiency of callus induction and plant regeneration. When embryos were cultured together with endosperm （endosperm-supported culture, ES）, the percentage of callus induction was significantly lower than that when embryos were cultured in the absence of endosperm （non-endosperm-supported culture, NES）. This pattern was evident in most genotypes, regardless of whether 2 or 8 mg L^-1 2,4-D was added in the NES culture. However, in ES culture, more induced calli were differentiated into distinct green spots and they further developed into plantlets. Thus, more plants were regenerated in ES culture than in the NES treatment. Most of the eight tested genotypes showed a significant difference in callus induction rate and plantlet regeneration in both ES and NES cultures. In addition, the enzymatic activity of oxalate oxidase in the callus of ES culture condition was obviously higher than that in the callus of NES culture condition, suggesting that the activity of oxalate oxidase may be a parameter for selection of calli with potential for plantlet regeneration. These results indicate that wheat mature embryos are valuable explants for highly efficient callus induction and plant regeneration, if proper treatment and medium are used.