猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素基因的克隆与表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清2型标准菌株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增ApxⅣ毒素基因特异片段1.5 kb左右,将PCR产物纯化后与pMD18-T连接并测序,结果该片段的碱基序列与GenBank中标准株序列的同源性为98%。随后将该片段亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）的多克隆位点,经鉴定后得到重组质粒pET-ApxⅣ,将此重组质粒转化到受体菌BL21-DL3中,并用诱导剂乳糖进行诱导表达,5 h后表达达到高峰。经12%SDS-PAGE电泳检测,表达得到的融合蛋白约为61 000。经Western blotting分析,表达蛋白能与APP阳性血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应。     

猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅳ A2．5kb基因片段的分子克隆及其表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株72—1株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2．5kb特异片段，将其克隆于pMD 18-T中，经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AⅪ302405)基因进行比较，结果显示核苷酸同源性为99．5％。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的EfoRⅠ／SalⅠ位点，成功地构建了重组表达载体pGEX—apxⅣA，并转化大肠埃希氏菌BL2l，获得了表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为117ku，与预期片段大小相符；Western-blotting分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆及其原核表达

参照GenBank上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型菌株(AF363361)的apxⅠA基因序列设计了1对特异性引物，用PCR法扩增apxⅠA基因，获得了3069bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体，经酶切、PCR鉴定和序列分析，表明克隆是成功的。再将长为1149bp的apxⅠA基因的部分片段(编码ApxⅠ的N-端的片段)插入到原核表达载体pET-28(a)中，构建了重组表达质粒pET—apxⅠA，转化大肠埃希氏菌JM109(DE3)，在IPTG诱导下获得了高效表达，经SDS-PAGE检测，证实表达产物大小约为41ku。     

胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅠBD基因特异性片段的克隆及表达

以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型标准菌株基因组为模板，用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段；对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中，构建重组表达质粒pETIBD；转入大肠埃希氏菌BL21中，以IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE电泳。结果，从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100％，长1447bp，编码482个氨基酸，所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku，与预期的大小相符。结果表明，含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。     

胸膜肺炎放线杆菌3种Apx毒素及外膜蛋白Omp2的原核表达及免疫反应性鉴定

猪传染性胸膜肺炎是猪群一种常见的细菌性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了对胸膜肺炎放线杆菌的感染情况进行监测,本研究设计了针对该菌毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp2的全基因PCR扩增引物,以实验室保存的血清2型和5型菌株基因组DNA作为模板成功扩增出特异性基因片段,分别将目的片段克隆入原核表达载体成功构建重组表达质粒pColdI-omp2、pColdI-ApxⅡ、pET-32am-ApxⅠ、pCold-ProS2-ApxⅢ。将重组质粒转化Rosetta感受态细胞,通过IPTG诱导表达,应用His单克隆抗体和临床阳性猪血清对表达的重组蛋白上清进行Western blot分析,结果表明表达蛋白的分子量大小与预期相符,通过诱导条件的优化可以稳定表达可溶性蛋白,可溶性蛋白能与His单克隆抗体和临床阳性猪血清发生特异性反应,证明重组蛋白具有良好的免疫反应性。该试验为后期建立胸膜肺炎放线杆菌抗体的ELISA检测方法奠定基础。     

胸膜肺炎放线杆菌4型菌毛亚单位基因apfA特异性片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板，PCR扩增其apfA特异性基因片段，PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切及序列分析鉴定后，亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，构建重组表达质粒pGEX-apfA，转化到感受态大肠杆菌DE3中，以IPTG进行诱导，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98％，所表达的融合蛋白相对分子质量约为42000，与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

胸膜肺炎放线杆菌血清10型ApxIA基因的克隆及原核表达

Apx毒素在胸膜肺炎放线杆菌致病性和免疫原性方面具有重要作用。为研究ApxI毒素的免疫活性,参照胸膜肺炎放线杆菌血清10型ApxIA基因核酸序列（D16582）设计1对引物．利用PCR自该菌株基因组DNA中扩增出3158bp的ApxIA基因片段,经克隆和序列测定后转入原核表达载体pET-32a中,通过转化BL21（DE3）并在IPTG诱导下进行原核表达,表达出约的融合蛋白,SDS-PAGE和Westernblotting鉴定结果显示表达产物大小约120kDa,且表达产物可与该菌株免疫兔血清发生结合反应。ApxIA基因的克隆和原核表达为研究ApxI毒素的免疫原性以及在胸膜肺炎放线杆菌中的生物学活性奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因特异片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组表达质粒pGEX-apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,25-4株apxIVA gene与基因库中标准7型apxIVA gene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符.apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础.     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用

根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计1对引物，扩增特异的650bp棱酸片段，建立了应用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明，12个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp特异性的核酸片段，而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，PCR的最低检出限量为500个放线杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省不同地区分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌菌株进行检测．结果14株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明，病变部位不同，胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同，其中以扁桃体的检出率最高。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIVA基因特异片段的克隆和表达

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25＿4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18＿T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX＿6P＿1中,构建成重组表达质粒pGEX＿apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS＿PAGE电泳。结果表明,25＿4株apxIVAgene与基因库中标准7型apxIVAgene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符。apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础。     

突变缺失Apx毒素分泌蛋白基因apxⅢB和apxⅢD的胸膜肺炎放线杆菌血清2型的构建与鉴定

经鉴定,Apx毒素是猪胸膜肺炎的病原体—胸膜肺炎放线杆菌的重要毒力因子。在一些胸膜肺炎放线杆菌血清型中,Apx毒素是由apxⅢB和apxⅢD编码后经细胞膜分泌的。为了构建1株抗胸膜肺炎放线杆菌的活疫苗株,笔者将胸膜肺炎放线杆菌血清2型菌株-1536的apxⅢB和apxⅢD基因进行灭活,从而构建DeltaapxⅢB/DapxⅢD突变株(1536DeltaBDeltaD)。用活的1536DeltaBDeltaD胸膜肺炎放线杆菌对猪进行免疫后,能保护猪免于同源的野生型胸膜肺炎放线杆菌1536的攻击。因此,被损坏的Apx毒素分泌物可使胸膜肺炎放线杆菌的毒力减弱,并可作为开发胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗的有效策略。     

猪胸膜肺炎放线杆菌APXⅠ A蛋白的截断表达与鉴定

溶血外毒素(Apx)是胸膜肺炎放线杆菌(APP)最主要的毒力因子及保护性抗原。利用PCR技术扩增APP血清5型编码APXⅠN-端具有保护性抗原表位的APXⅠA部分基因,扩增片段长度为1 149 bp。将其插入原核表达载体PET-32a中,转化至E.coilBL21中诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明APXⅠA基因能在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白的分子量约为40 ku。Western-blot结果表明该融合蛋白能被APP阳性猪血清所识别,指示表达的蛋白具有良好的免疫活性,为建立猪传染性胸膜肺炎的诊治及高效亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素基因的克隆与表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌保护性免疫机制,试验筛选猪胸膜肺炎放线杆菌3~8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆,测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素(AT-Adhensin)基因,根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该黏附素蛋白。结果表明,该蛋白与猪传染性胸膜肺炎康复期血清发生反应。     

猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白基因的克隆与表达

研究通过筛选猪胸膜肺炎放线杆菌3～8 kb随机基因组文库获得1株阳性克隆.测序拯救质粒得到序列,通过BLAST分析确定此片段为猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白基因,预计成熟蛋白分子质量为45.716 ku.根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该Ⅱ型分泌蛋白.Western-blot结果表明,该蛋白能与猪胸膜肺炎放线杆菌康复期血清发生反应.     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础.     

应用PCR技术快速检测猪胸膜肺炎放线杆菌

为了研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的快速检测技术,试验采用GenBank中猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APXⅣA基因的序列设计了1对引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌的PCR方法。结果表明:猪胸膜肺炎放线杆菌血清1～10型均能扩增出预期片段,而金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性;用该方法检测自猪鼻腔采集的87份鼻拭子,有15份为阳性,72份为阴性。说明建立的猪胸膜肺炎放线杆菌PCR方法可用于猪胸膜肺炎的快速诊断。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离及PCR诊断方法的建立

APXⅣA基因是新发现的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的RTX毒素基因,本文通过PCR方法从APP标准血清1型及临床分离到的3株野毒株中扩增出长为442 bp的部分APXⅣA基因,而从其它引起猪呼吸道疾病的细菌中无法扩增出此片段.通过玻板凝集试验鉴定这三株野毒株为血清1型APP.所建立的PCR方法能检测的DNA量最高敏感度为28pg.表明本文所建立的对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR诊断方法具有较高的特异性和敏感性.     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白（OMP）5’末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板，PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5’末端保守区基因片段(OMPc)，酶切及核苷酸序列分析鉴定后，与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接，构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc，转入大肠杆菌B121中，以IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳分析发现，转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34kD，与实际预测相符，命名为GST-OMPc。GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测。结果表明：纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应。OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础。     

猪传染性胸膜肺炎的PCR快速诊断及基因组酶切分析

为了建立猪胸膜肺炎放线杆菌(Actionbacillus pleuropneumoniae,APP)快速PCR诊断方法,试验依据APP的毒素基因Apx ⅣA的序列设计引物,对江西农业大学动物科学技术学院预防兽医学教研组保存的4个血清型APP菌株以及大肠埃希杆菌、沙门杆菌进行PCR扩增,同时对提取的4个血清型菌株的基因组DNA用EcoRⅠ酶切。结果表明:4个APP菌株均成功扩增出预期大小的基因片段,而其他G-菌没有扩增出;4个血清型菌株的基因组DNA经EcoRⅠ酶切后酶切片段有所不同。