红色素产生菌RZ21菌株的原生质体紫外诱变育种研究

[目的]对红色素生产菌RZ21菌株的原生质体进行紫外诱变育种,以提高其红色素的产量。[方法]以粘质沙雷氏菌为供试菌种,研究其原生质的制备、再生的条件和该菌的原生质紫外诱变对红色素产量的影响。[结果]RZ21菌株以溶菌酶8 mg/ml,37℃作用30 min后,再加0.01 mol/L（终浓度）的EDTA作用20 min,原生质体形成率达81.9%,再生率达31.5%。该菌原生质体经紫外诱变原生质体处理及抗性平板、摇瓶两步筛选后,得到1株高产株RZ21-3,灵菌红素产量达到了0.813 g/L,比原始菌株提高了24.9%。[结论]溶菌酶8 mg/ml,37℃作用30 min后,再加0.01 mol/L（终浓度）的EDTA作用20 min为该菌原生体制备的最佳工作条件。     

离子排斥色谱法测定米根霉富马酸发酵液中富马酸含量

[目的]快速、准确测定米根霉富马酸发酵液中的富马酸含量。[方法]在柱温65℃、流动相为5 mmol/L硫酸水溶液、流速为0.8ml/min的色谱条件下,采用离子排斥液相色谱法测定米根霉富马酸发酵液中的富马酸含量。[结果]富马酸的保留时间为10.450 min,其他杂质不干扰测定。离子排斥液相色谱法在富马酸质量浓度为0.5~5.0 g/L时具有良好的线性关系,相对标准偏差为0.667%,回收率达98%以上。发酵时间分别为12、487、2 h的米根霉富马酸发酵液中的富马酸的质量浓度分别为5.712、36.4205、6.449 g/L,RSD分别为1.040%0、.667%和0.430%。[结论]离子排斥液相色谱法测定米根霉富马酸发酵液中的富马酸含量的速度快,重现性好,准确度高,结果可靠。     

纳他霉素高产菌株的诱变选育

以褐黄孢链霉菌(ATCC13326)为出发菌株,紫外诱变后,结合链霉素抗性筛选法选育纳他霉素高产菌株.原始菌株活化后,测定其最小链霉素抑制质量浓度为8 μg/mL.采用90% 的紫外致死剂量,照射108 mL-1 ATCC13326孢子悬液,诱变后涂布于8 μg/mL链霉素选择培养基上,筛选链霉素抗性突变株.通过形态指标初步选择5株突变株进行发酵性能测定,种子培养26 h,摇瓶发酵96 h,用紫外分光光度计在303 nm下测定其吸光值,计算纳他霉素发酵产量.结果表明原始菌株纳他霉素发酵产量为1.229 g/L,诱变获得的两株高产突变株纳他霉素发酵产量分别为1.552和1.776 g/L,分别高出原始菌株26.3%、44.5%.     

1,3-丙二醇高产变异菌株的紫外诱变选育

在高效液相色谱同时检测多种组分的基础上,建立了高效液相色谱法测定克雷伯杆菌Klebsiella pneumomiae发酵甘油产物1,3-丙二醇(1,3-PD)含量的方法;同时应用单因素考查法确定较优的筛选高产1,3-PD生产菌株紫外诱变条件,并在逐步提高筛选平板培养基中甘油浓度(60～90g/L)的情况下经多轮诱变筛选,获得1株能够耐较高浓度甘油的高产1,3-PD的变异菌株.经考查,较优的紫外诱变条件为:紫外灯功率30W,照射距离34cm,菌体浓度108个·mL-1,稀释10-5倍后进行诱变筛选,较优照射时间为6min;经6轮诱变筛选,筛选出能够耐90g/L甘油的高产1,3-PD的变异菌株KVI-1,其1,3-PD的产量较原始菌株提高30%左右;变异菌株经6代遗传稳定性考察,甘油转化率均稳定在45%左右,1,3-PD产量稳定在40g/L左右,变异菌株KVI-1可作为生产工艺研究的出发菌株.     

高压电晕电场对出芽短梗霉菌诱变的研究

[目的]通过研究高压电晕电场诱变对出芽短梗霉多糖产量的影响,筛选出高产优质的出芽短梗霉菌株。[方法]采用高压电晕电场对出芽短梗霉进行诱变,在临界放电电压下诱变不同时间,测定出芽短梗霉的性状和多糖产量的变化。[结果]在临界放电电压4.4 k V下的最佳诱变时间是60 min;经过2次连续诱变,多糖产量达到9.57 g/L,是原始菌株的3倍多,发酵液颜色为米白色,最终p H为4.2左右;连续传代培养10代,其生状和产量无明显变化,传代稳定。[结论]高压电晕电场对出芽短梗霉菌的普鲁兰产量提高有显著作用。     

原生质体诱变结合复合抗性筛选杆菌肽高产菌株

[目的]筛选杆菌肽的高产菌株。[方法]将原始菌株经活化后制备原生质体,采用紫外照射75s后再用终浓度为100μg／ml的NTG诱变通过硫酸链霉素＋杆菌肽复合抗性平板筛选杆菌肽的高产菌株。[结果]经过7轮诱变,一共分离了1000个菌株（筛选过的所有菌株）;最终获得C-67号高产菌株,其杆菌肽效价达到963．2957U／ml,相比原始菌株提高22．34％。C-67连续传代5次后,产量仍稳定,表明其遗传稳定性较高。[结论]原生质体诱变结合复合抗性筛选是一种简单高效的微生物育种及筛选方法。     

基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1 152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%～15%增加至30%～35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl1215-5和Gen1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。     

丙酮丁醇梭菌复合诱变及发酵废弃物原料产生物丁醇的研究

[目的]通过废弃资源的再利用研究可替代的新型生物燃料——丁醇的发酵培养基。[方法]对菌株Clostridium acetobutylicum CGMCC 1.0134进行紫外诱变和磁场与Fe~(2+)共同诱变,获得1株丁醇产量高和稳定性好的优良突变株Clostridium acetobutylicum UM-80,采用不同的废弃原料考察该突变菌株的发酵性能,并筛选出合适的性价比高的培养基。[结果]突变株UM-80发酵产丁醇和总溶剂(丙酮、丁醇、乙醇)分别为9.04、17.95 g/L,较原始菌株分别提高了5.12%、4.12%。单独的蕨根是较好的丁醇发酵原料,当蕨根醪质量分数为15%时发酵液中丁醇浓度最高为5.50 g/L。当高山被孢霉与蕨根共同发酵时发酵液中丁醇最高产量为6.50 g/L。[结论]蕨根与高山被孢霉的复合培养基是较好的生物丁醇发酵培养基。     

TiCl_3法快速筛选L-苹果酸高产突变株

[目的]探讨并验证TiCl3法筛选L-苹果酸高产突变株的可行性。[方法]将34株米根霉诱变株及出发株(CK)分别接种到含葡萄糖的发酵培养基中发酵96 h,发酵液经稀释后加入TiCl3,根据沉淀发生情况,筛选L-苹果酸高产突变株。[结果]当发酵液稀释40倍时,有4株诱变株发酵液产生沉淀,而出发株发酵液未产生沉淀。据此筛选出4株发生显著正突变的诱变株,其L-苹果酸产量约为16~20g/L。其发酵液经HPLC测定分析,表明4株突变株发酵液中L-苹果酸的产量为15.88~18.26 g/L,而出发株L-苹果酸产量为11.76 g/L,突变株L-苹果酸产量增幅达35%~55%。[结论]TiCl3法可有效应用于L-苹果酸高产突变株的筛选。     

木霉菌素产生菌的诱变育种

[目的]筛选高产木霉菌素菌株,提高木霉菌素产量。[方法]以从枸骨中分离到的产木霉菌素的内生真菌———哈茨木霉为出发菌株,进行紫外线二次复合诱变处理,将筛选出的突变菌株连续转接5代,测定其遗传稳定性。[结果]随着照射时间的延长,哈茨木霉的致死率增大,选取致死率为88.1%的紫外线照射45 s作为最适处理剂量进行诱变育种。经过2次诱变的菌株的产孢时间提前,长出的菌落更为致密。经过初筛和复筛,最终获得1株高产突变株UV-5-3,其产抗生素的水平最高,为164.75μg/m l,比初次诱变筛选获得的突变株UV-3-1提高了56.77%,是出发菌株的2.3倍。传代试验表明,突变株UV-5-3的高产性能遗传特性稳定。[结论]利用紫外线二次复合诱变处理哈茨木霉可以获得高产木霉菌素菌株。     

橙色红曲菌pyrG缺陷株的筛选及鉴定

[目的]筛选和鉴定橙色红曲菌pyrG缺陷株。[方法]以橙色红曲菌AS3.4384（Monascus aurantiacus）为出发菌株,运用紫外照射致基因突变,随后对尿嘧啶依赖型菌株的pyrG基因进行测序比对,筛选pyrG基因突变株,最后用含有米曲霉pyrG基因的pAOP互补质粒对其进行基因转化试验。[结果]经紫外诱变得到一株尿嘧啶依赖型的5-FOA抗性菌株UM28。扩增其pyrG基因并进行测序,发现UM28的pyrG基因在核苷酸序列＋220bp的位置发生了突变,进而导致氨基酸水平上Pro→Ser的突变,造成了乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的失活。UM28通过基因转化能够接受含有米曲霉pyrG基因的互补质粒恢复野生表型,且回复突变率低于10-8,能够用于红曲菌同源转化系统的构建。[结论]获得了一株红曲菌pyrG基因缺陷株UM28,它可被用作基因工程的受体菌。     

产碱性蛋白酶海洋菌的诱变及其酶学性质的初步研究

[目的]筛选出高产碱性蛋白酶的菌株,为其在生产中的应用提供依据。[方法]从青岛沿海海域采集的海水及海泥中分离得到产碱性蛋白酶的菌株,经紫外诱变和微波诱变处理,获得目标菌株并测定菌株的酶活力,同时对诱变菌株的酶学性质进行初步的研究。[结果]筛选出的菌株酶活力为145 U/ml,经过复合诱变后,菌株ZR-58-3-1-3发酵液的酶活力达775 U/ml,比出发菌株高4.3倍。菌株所产碱性蛋白酶的最适反应温度为45℃,属中温蛋白酶;最适作用pH为8.5,具有较高的热稳定性。[结论]菌株ZR-58-3-1-3产碱性蛋白酶的性能稳定,可作为产碱性蛋白酶的突变菌株。     

紫外-光复活诱变香兰素生产菌株的研究

[目的]探究紫外诱变和光复活修复对生产香兰素菌株的效果。[方法]通过紫外诱变和光复活修复对香兰素生产菌链霉菌(Streptomycessp.L1936)进行复合诱变,筛选出香兰素高产菌株(Streptomycessp.L1936-9)。[结果]出发菌株经过紫外诱变和光复活修复处理后,脱乙酰酶酶活提高了71.1%,香兰素氧化酶酶活降低了34.6%相应的香兰素产量提高了34.2%。[结论]该研究为香兰素生产提供了良好途径。     

酸性α-淀粉酶高产菌株的原生质体诱变选育

[目的]以产酸性α-淀粉酶菌解淀粉芽孢杆菌B-5为出发菌株,通过对B-5原生质体进行紫外线诱变以达到提高产酸性α-淀粉酶活力的目的。[方法]在溶菌酶浓度为20 mg/ml,37℃酶解90 min条件下,原生质体制备率达到94%。然后经紫外线诱变处理,从中筛选水解圈与菌落比值较大者进行发酵,测定酸性α-淀粉酶活力。[结果]从大量突变菌株中筛选得到1株α-淀粉酶活力为267 U/ml的突变菌株UV-329,其产酶活力较出发菌株B-5提高了254.2%。[结论]利用紫外线对解淀粉芽孢杆菌B-5原生质体进行诱变是一种有效的微生物育种方法。     

紫外诱变选育谷氨酰胺合成酶高产菌株及其酶学性质研究

[目的]采用紫外诱变的方法选育谷氨酰胺合成酶高产菌株,并对其酶学性质进行研究。[方法]以紫外诱变选育谷氨酰胺合成酶产生菌Arthrobacter globiformis A0014,通过测定其谷氨酰胺合成酶酶活力,获得高产突变株,之后进一步对其酶学性质进行研究。[结果]获得高产突变株Y3。该菌株经多次传代,遗传性状稳定,其谷氨酰胺合成酶摇瓶发酵单位是出发株的2.81倍。突变株谷氨酰胺合成酶最适反应温度为40℃,最适pH值为6.5。[结论]所获得的突变株酶活的提高以及最适反应温度的下降有利于酶法合成谷氨酰胺,在工业生产中将有较好的应用前景。     

微波诱变筛选无色素黄原胶产生菌

[目的]筛选出含色素较少或无色素的黄原胶生成菌株,生产高品质的透明黄原胶,促进黄原胶发酵工业的发展。[方法]经过各个平板内比较、各个稀释度内比较、各个试验组内比较及各种条件试验内的单菌落颜色比较,选取出发菌株。对出发菌株进行微波照射诱变,并选取最佳照射条件。[结果]在微波强度为60%的条件下照射40s,每隔10s进行冷却为最佳的黄单胞菌微波诱变条件。经显微镜检测、连续传代后的菌落形态观察及所产黄原胶的比较结果表明,该试验使用微波诱变筛选已获得1株产生无色素黄原胶的黄单胞菌caM45-5突变株,该突变株可用于生产高品质的透明黄原胶。[结论]为生产高品质的透明黄原胶、减少黄原胶提取工艺过程提供了方便。     

纤维素酶产生菌的诱变与筛选

[目的]为提高纤维素酶产生菌的酶活力。[方法]以抚顺近郊堆积腐烂秸秆的土壤为分离源,利用CMC刚果红平板培养基筛选出纤维素水解圈与菌落直径比值(Hc值)较大的菌株Y-07。以Y-07为出发菌株,在最适诱变剂量条件下,对其进行紫外线诱变和亚硝酸诱变。[结果]经过3轮复筛,紫外线诱变后的U10菌株为试验中获得的高产纤维素酶菌株,其酶活最高达到2.499 IU/ml,其活性是Y-07的3.41倍。[结论]该方法为进一步提高纤维素酶产生菌的酶活力奠定了基础。     

L-缬氨酸产生菌JVHK597的选育及无机盐对其产酸量的影响

[目的]筛选L-缬氨酸高产菌株并研究其发酵条件。[方法]以黄色短杆菌（Brebvibacterium flavum）突变株ZGH6128为出发菌株,采用紫外线（UV）、硫酸二乙酯（DES）和亚硝基胍（NTG）3种诱变剂进行诱变处理,通过摇瓶培养筛选出L-缬氨酸高产突变菌株。[结果]经过UV、DES和NTG 3种诱变剂处理菌株ZGH6128,逐步获得菌株JVHK597,并具有Leu营养缺陷、Ile营养缺陷、Met营养缺陷、α-AB抗性、2-TA抗性5种遗传标记。在未优化的条件下,菌株JVHK597摇瓶发酵72 h的产酸量达41.2 g/L。8次传代试验结果表明,菌株JVHK597的产酸能力稳定,经鉴定,菌株JVHK597的基因型为（Leu-,Ile-,Met-,α-ABr,2-TAr）,遗传标记具有稳定性。发酵培养基中硫酸镁（MgSO4.7H2O）和磷酸二氢钾的含量分别为0.6和1.4 g/L时,最有利于菌株生产L-缬氨酸。[结论]试验筛选出了L-缬氨酸高产菌株JVHK597,并为其发酵培养提供了指导。