虾肝肠胞虫的3种快速显微镜检查法

虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei是近年来备受关注的病原性微孢子虫,严重影响对虾生长,并在东南亚及我国大部分对虾主产区迅速蔓延,极大地制约对虾养殖业的健康发展.特异、快速、便利地确诊EHP感染,在对虾育种、育苗及养殖过程中具有重要意义.本研究基于微孢子虫的孢子具有高度折光性,孢壁结构含较厚几丁质层及碘化丙啶可穿透孢子活细胞膜的特性,开展虾肝肠胞虫的光学显微成像研究,展示普通光镜法、微分干涉差显微成像法、荧光增白剂(fluorescent brightener 28)染色法及与碘化丙啶(Propidium Iodide)共染的双色荧光法在虾肝肠胞虫快速光镜检测诊断中的应用.实验建立的双色荧光镜检法无需固定和洗涤,具有操作简便,无专业技术要求的特点,可在10 min内完成样品的初筛检测,为虾肝肠胞虫的早期筛查及养殖塘样品快速诊断提供价廉、省时且易操作的检测手段.     

凡纳滨对虾3种主要病毒和虾肝肠胞虫在辽宁地区的流行情况分析

为解决近年来辽宁地区凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei病害频发的问题,于2015年8月从辽宁省盘锦、营口地区26个发病的凡纳滨对虾养殖池塘中随机采集病虾样本,采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)和对虾桃拉综合征病毒(TSV),并用环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplication,LAMP)技术检测虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei(EHP)的感染情况。结果表明:IHHNV和EHP的检出率较高,分别为65.4%和34.6%,WSSV和TSV的检出率分别为19.2%和7.7%;EHP的检出率与对虾体型大小密切相关,在小虾样本中检出的阳性率高达100%,而大虾样本中均未检出;26份对虾样本中有7份样本同时携带EHP和IHHNV。研究表明,IHHNV和EHP是2015年8月辽宁地区凡纳滨对虾的主要流行病原,发病率可能与对虾生长缓慢、个体大小差异明显相关。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)SWP2基因的克隆、表达及其在虾类病害检测中的应用

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是虾类养殖过程中一种非常重要的病原微生物.目前常用的EHP检测方法是以核糖体18S基因为靶基因的PCR检测,但由于18S基因的高度保守性,该方法存在一定的非特异性扩增问题.本研究利用电子克隆方法,得到了特异性较高的EHP孢壁蛋白2(spore ...     

基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

【目的】基于TaqMan-MGB探针建立虾肝肠胞虫(EHP)荧光定量PCR检测方法,为EHP的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】以EHP的SSU rDNA基因为检测靶基因,在其保守区设计特异性的扩增引物和TaqMan-MGB探针,将PCR扩增目标片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP)(标准品),以标准品DNA为模板优化反应体系,建立检测EHP的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR;以10倍梯度稀释的标准品DNA为模板构建扩增标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的重组质粒pMD18-T-SSU~(EHP )DNA稳定性好,可满足作为标准品和阳性对照的要求;标准品(pMD18-T-SSU~(EHP))起始模板范围为2.0×10~1～2.0×10~9拷贝/反应时,建立的标准曲线线性关系良好,对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51。基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对临床虾样品EHP的检测灵敏度约10拷贝/mg,较农业农村部推荐的套式PCR约提高10倍;对虾类其他常见病原均无扩增反应,其组内和组间变异系数分别为0.26%～0.72%和0.56%～0.92%,整个检测过程可在1 h内完成。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品进行检测比较,发现两种方法的符合率为96.7%,检测低拷贝数虾样品时前者具有更高的灵敏度;2018和2019年广西虾样品的EHP阳性检出率分别为16.2%和30.6%。【结论】基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品的EHP定量检测,可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。     

基于环境DNA的进口凡纳滨对虾携带水传播虾肝肠胞虫风险评估

【目的】基于环境DNA（eDNA）分析进口凡纳滨对虾携带水传播和运输虾肝肠胞虫（EHP）的风险性,为环境水中疫病监测和风险评估提供参考依据。【方法】取60批进口亲虾携带水用0.45 μm硝酸纤维素膜过滤并提取eDNA,挑取10个携带水样滤膜eDNA用于凡纳滨对虾物种特异性鉴定,采用实时荧光定量PCR对所有携带水样滤膜进行EHP检测;同时以EHP阳性进口亲虾携带水开展人工感染试验,感染10 d后分别取养殖水样及虾体进行EHP检测;对进口亲虾携带水EHP阳性滤膜进行宏基因组测序分析,采用Krona对物种注释结果进行可视化展示,并将宏基因组测序分析结果与NCBI已公布的EHP氨基酸序列进行BLAST比对分析。【结果】进口亲虾携带水检测结果显示,成功从10个携带水滤膜eDNA扩增出凡纳滨对虾347 bp的特异目的片段,与原始序列片段的相似性达100%;在60批进口亲虾携带水样品中有2批携带水呈EHP阳性。EHP阳性进口亲虾携带水能成功感染虾苗组,且在虾苗肝胰腺组织分离获得成熟的EHP孢子,但亲虾组的虾体EHP检测呈阴性。宏基因组测序得到EHP的物种相对丰度值占真核动物物种的0.7%;与NCBI已公布的EHP氨基酸序列进行BLAST比对,结果获得213个同源EHP氨基酸序列;从进口亲虾携带水样品中分离鉴定获得的EHP与已报道物种黄道蟹肠孢虫（Enterospora canceri）和毕氏肠胞虫（Enterocytozoon bieneusi）的亲缘关系较近,对应的氨基酸序列相似性为别为83%和81%。【结论】进口凡纳滨对虾亲虾携带水具有传播EHP的可能性,即仅针对亲虾虾体进行EHP检测具有不完全性。eDNA检测可用来补充传统的虾体疫病监测方法,作为水环境疫病检测和风险评估的重要手段。     

广东沿海地区凡纳滨对虾EHP、VPAHPND和SHIV感染情况调查与分析

[目的]掌握广东沿海对虾主养区虾肝肠胞虫(EHP)、急性肝胰腺坏死病致病性副溶血弧菌(VPAHPND)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)3种病原的流行趋势及特点,为广东省对虾养殖业的病害防控提供参考依据.[方法]建立针对EHP、VPAHPND和SHIV的PCR检测方法,在广东茂名和汕尾两地区采集凡纳滨对虾样品检测EHP、VPAHPND和SHIV 3种病原,并针对生长缓慢或个体规格差异明显的部分养殖凡纳滨对虾进行病原感染情况调查.[结果]广东茂名地区凡纳滨对虾幼虾的EHP、VPAHPND和SHIV携带率分别为20.24%、2.38%和9.52%,汕尾地区凡纳滨对虾幼虾的EHP、VPAHPND和SHIV携带率分别为26.98%、4.76%和42.86%.根据养殖模式划分,土塘养殖凡纳滨对虾幼虾以携带EHP为主,携带率高达40.48%;高位池养殖凡纳滨对虾幼虾主要感染SHIV,携带率为29.27%;工厂化池塘中,凡纳滨对虾幼虾的EHP和SHIV携带率较高,分别为21.88%和23.44%.池塘水、水源水、虾苗及丰年虫等养殖要素均能检出病原,其中池塘水和水源水中EHP和SHIV的检出率较高.对个体规格差异明显的患病凡纳滨对虾群体进行检测,结果发现大、小规格样品的EHP感染率分别为30.00%和80.00%;在表现生长缓慢的患病凡纳滨对虾群体中,大、小规格幼虾样品的EHP携带率分别为95.00%和100.00%.[结论]广东沿海地区养殖凡纳滨对虾的EHP和SHIV携带率较高、流行趋势明显,而VPAHPND检出率较低、流行趋势不明显.养殖水体是EHP、VPAHPND和SHIV的重要传播媒介,生物饵料也是养殖过程中病原传播的源头.因此,在实际生产中应根据养殖凡纳滨对虾的病原流行特点,尤其针对EHP和SHIV高携带率的现象,从病原、宿主和环境三方面同时着手进行防控,采取综合防控措施减少病害发生.     

虾肝肠胞虫病的研究进展

2004年,泰国研究者在生长缓慢的斑节对虾中发现一种未知的微孢子虫,经过后续的研究命名为肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)。肝肠胞虫大小为0.7μm×1.1μm,形状呈卵圆形或梨形,是一种严格细胞内寄生的微孢子虫。EHP不仅可以经过摄食携带EHP的鲜活饵料、病死虾等进行传播,还可以经过含孢子虫的水体进行传播,在商品化冷冻桡足类、商品化卤虫卵、商品化卤虫幼体等中都可以检出EHP。能够携带EHP的生物种类多加上其传播方式多样增加了对EHP的防控难度,导致其在世界范围内大面积流行。除我国大部分省市有检出报道外,在泰国、印度、文莱、越南、委内瑞拉、印度尼西亚和马来西亚等国家均有不同程度的检出,且检出率呈逐年上升趋势,该寄生虫已成为凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖过程中最重要病原之一,感染EHP虾个体大小不均匀,并伴随着细菌感染,大大降低了对虾产量,正严重威胁着整个对虾养殖产业的经济效益。如何提前发现,预防并治疗该寄生虫已成为必须解决的产业问题。明确EHP的生活史、传播途径和感染机制有助于更好的进行防治。综合国内外文献,对肝肠胞...     

虾肝肠胞虫研究进展

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是造成养殖虾类生长迟缓症状的主要病原。本文介绍EHP的分类地位、显微特征、发现史,综述传播途径、检测方法和防治技术研究进展。     

南美白对虾4种病原体可视化快速检测试剂盒(生物芯片法)的研发

利用反向点杂交技术,研制灵敏度较高的南美白对虾4种病原体检测试剂盒,其检测指标包括致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、对虾肝肠胞虫(EHP),用重组质粒分别对其进行了最低检测限测试,并与现有推荐方法进行比较。本研究研发的检测试剂盒对4种病原体的最低检测限为1μl 10～100拷贝。特异性检测结果表明,4种病原体彼此不产生交叉反应,特异性良好,与各病原体推荐检测方法的结果相比,阳性符合率完全一致。本研究研发的检测试剂盒具有操作方便,灵敏度高,特异性好,检测时间短,设备要求简单等特点,适合应用于南美白对虾VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP的检测、筛查工作中。     

虾肝肠胞虫的3种快速显微镜检查法

虾肝肠胞虫Enterocytozoon hepatopenaei 是近年来备受关注的病原性微孢子虫,严重影响对虾生长,并在东南亚及我国大部分对虾主产区迅速蔓延,极大地制约对虾养殖业的健康发展.特异、快速、便利地确诊EHP感染,在对虾育种、育苗及养殖过程中具有重要意义.本研究基于微孢子虫的孢子具有高度折光性,孢壁结构含较...     

四种南美白对虾常见病原微流控芯片联检方法的测试

为评估微流控芯片法在虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血性弧菌(VpAHPND)、十足目虹彩病毒1(DIV1)和白斑综合征病毒(WSSV)4种南美白对虾常见病原联检中的各项性能，设计针对上述4种病原扩增反应的引物，对已有芯片进行新的功能划分，同时优化该基因芯片的反应体系及恒温扩增条件。结果表明，优化的联检方法可同时检测上述4种病原，特异性好，30 min反应时间即可给出病原联检结果。EHP、 DIV1、WSSV、VpAHPND指标检出限分别为1μl 0.57拷贝、0.43拷贝、2.12拷贝、3.18拷贝，已达到甚至超过了环介导等温扩增技术(LAMP)检测的灵敏性。本次测试中的南美白对虾4种病原微流控芯片联检方法所用的检测试剂盒具有操作简便、检测灵敏、特异性强、检测时间短、设备要求简单等特点，适合整个养殖过程中对南美白对虾EHP、VpAHPND、DIV1和WSSV的监测与筛查工作。     

氨氮胁迫对凡纳滨对虾的生长状况及虾肝肠胞虫(EHP)携带量的影响

以凡纳滨对虾为研究对象,设置0.1 mg/L(空白组)和6.0(试验组Ⅰ)、9.0 mg/L(试验组Ⅱ)3个氨氮浓度组,研究氨氮胁迫对其生长状况及虾肝肠胞虫(EHP)携带量的影响。结果表明,氨氮对EHP的影响有一定的时间-剂量效应,随着时间的增长,凡纳滨对虾EHP感染率呈上升的趋势;9.0 mg/L氨氮可以有效促进感染EHP凡纳滨对虾体长和体重的增长。试验期间,试验组Ⅱ凡纳缤对虾大虾增长率最高,且小虾的比例明显下降。试验组Ⅱ抑制EHP表达的效果优于空白组和试验组Ⅰ。     

对虾桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速检测方法的建立

根据对虾桃拉综合征病毒（TSV）结构蛋白基因保守序列,利用Primer Explorer 40软件设计了4条引物,建立桃拉综合征病毒环介导逆转录等温扩增快速（RT LAMP）检测方法,对反应温度和反应时间等参数进行了优化;同时将建立的RT LAMP检测方法与RT PCR进行比较分析,RT LAMP的检测灵敏度比RT PCR高10倍。结果表明,RT LAMP最适反应在60 ℃恒温条件60 min内完成,凝胶电泳呈现梯型条带;反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色的阳性结果明显区别于橙色阴性结果;RT LAMP对感染TSV的对虾检测呈阳性,而对对虾其他常见病原检测均为阴性,具有高的特异性。     

采用环介导等温扩增技术快速检测猪丹毒丝菌病原体

[目的]建立猪丹毒丝菌(E.rhusiopathiae)毒力株的快速检测方法.[方法]利用快速灵敏的环介导等温扩增技术( Loop - mediated Isotherml amplification,LAMP)针对丹毒丝菌spa基因较为保守区域设计4条特异性LAMP引物,采用FTA(Flinders technology associates,FTA)滤膜法提取12种血清型丹毒丝菌,8种非丹毒丝菌及受感染小鼠血液的基因组DNA,分析LAMP环引物的特异性;比较LAMP与传统PCR方法的扩增敏感性和产物特异性.[结果]在61℃恒温条件下,LAMP法能够特异性扩增丹毒丝菌特异条带,与常规PCR扩增结果一致;灵敏度实验表明LAMP法检测猪丹毒丝菌的检测下限为2 CFU/mL,较传统PCR的敏感性(大于20 CFU/mL)至少高10倍.LAMP方法与PCR方法都能在小鼠感染模型血样中检测到浓度为200CFU(10-7)/mL以上浓度的丹毒丝菌.[结论]LAMP法与FTA滤膜法相结合在检测丹毒丝菌中具有潜在的应用价值.     

基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测肉制品中鸭源性成分研究

本研究建立1种基于TaqMan探针的实时荧光环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）(TaqMan—LAMP)检测方法,用于肉制品中鸭源性成分的快速鉴别。以鸭线粒体cytb基因的保守序列设计特异性引物,优化并建立基于TaqMan探针的实时荧光LAMP检测方法,对该方法进行特异性、灵敏度试验;同时与《GB/T38164—2019常见畜禽动物源成分检测方法 实时荧光PCR法》作比较,对市售肉制品进行检测,验证本方法的准确性。所建立的TaqMan-LAMP检测方法特异性强,仅鸭肉基因组DNA呈现特异性扩增曲线,30 min内完成检测,灵敏度为0.001%(w/w),重复性好,批次内变异系数CV为1.99%,对47份肉制品进行检测,检测结果与国标法相比,相对敏感性、特异性和符合率均为100%。本研究建立的鸭源性成分TaqMan-LAMP检测方法检测快速、特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于肉制品中鸭源性成分的快速检测。     

LAMP和巢式PCR检测克氏原螯虾白斑综合征病毒(WSSV)的比较

白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是克氏原螫虾(Procambarus clarkii)养殖生产中危害最大的病原之一,也是其他一些要经济虾类的主要病害,但是目前没有相应的有效治疗药物.为了减少WSSV对克氏原螯虾的危害,及早发现病原,以便采取相应措施将损失降到最小程度,笔者开展了以环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法检测克氏原螯虾WSSV的研究,并且与灵敏度非常高的巢式PCR检测法进行了比较.结果表明,用LAMP法可以快速、灵敏、特异性地检测克氏原螫虾WSSV,其灵敏度与巢式PCR相比,高出约500倍,且不需要专用的PCR仪,是检测WSSV的一种理想方法.该结果也为其他虾类的WSSV检测提供了重要参考.     

虾虹彩病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立检测虾虹彩病毒(SIV)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,为实现虾虹彩病毒病(SIVD)快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段.[方法]根据SIV的MCP基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的片段克隆至pMD18-T载体制备重组质粒pMD18-T-MCPSIV;优化反应体系及扩增条件后建立检测SIV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,以pMD18-T-MCPSIV为标准品绘制标准曲线,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性.[结果]制备的重组质粒(pMD18-T-MCPSIV)DNA稳定性好,满足作为标准品的要求;标准品起始模板范围为2.0×101~2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系.优化后的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR灵敏度高,对重组质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对虾组织SIV的检测灵敏度约10拷贝/mg,其临床检测的敏感性与套式PCR相当;与虾类其他常见病原无交叉反应,组内和组间变异系数分别为0.27%~0.54%和0.61%~0.95%,且扩增与产物分析同步完成,整个检测过程仅需1 h左右.采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床虾样品进行SIV检测,结果显示,两种方法的大部分检测结果一致,符合率为98.6%,但检测低拷贝数样品时前者具有更高的灵敏度.2018和2019年广西虾样品的SIV阳性检出率分别为19.7%和7.5%,且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾和红螯螯虾均检测到SIV阳性.[结论]基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品SIV检测,可为SIVD快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段.     

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。     

环介导等温扩增技术检测克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌

建立了环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。以副溶血性弧菌tlh基因作为靶基因,设计特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并分别采用LAMP检测方法和国家标准方法(GB/T4789.7-2008)对克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌进行检测。结果表明,建立的LAMP方法最低检出限为1×101 cfu/mL;对6种细菌共8株菌进行LAMP法扩增,仅3株副溶血性弧菌得到阳性扩增。建立的LAMP检测方法与国家标准检测方法检测结果一致,准确度高。     

虾肝肠胞虫水通道蛋白基因 EHP00_492 的克隆与表达特征分析

【目的】克隆虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）水通道蛋白编码基因 EHP00_492,分析其在 EHP 成熟孢子中的表达特征,为研究 EHP 水通道蛋白的功能提供理论基础。【方法】以虾肝肠胞虫为材料,克隆获得完整的 EHP00_492 基因,对其进行序列特征分析,构建 pCold-TF-EHP00_492 重组表达载体,转化至大肠杆菌中异源表达重组蛋白,制备兔多克隆抗体。利用蛋白免疫印迹实验和间接免疫荧光实验分析 EHP00_492 在 EHP 成熟孢子中的表达定位特征。 【结果】 EHP00_492 的编码基因全长 729 bp,由 242 个氨基酸组成,富含亮氨酸,预测分子量为 25 kD,无信号肽,含有 6 个跨膜结构域,具有 MIP 蛋白家族结构域和 2 个水通道蛋白保守的 NPA/G 基序。此外,EHP00_492 与其他微孢子虫水通道蛋白序列同源性较高,系统进化树分析结果显示,EHP00_492 与毕氏肠胞虫 EBI_27080 蛋白亲缘关系最近。AlphaFold 分析发现,EHP00_492与已鉴定的家蚕微孢子虫水通道蛋白 NbAQP 和兔脑炎微孢子虫水通道蛋白 EcAQP 的蛋白质三维结构高度相似,推测 EHP00_492 是一个潜在的水通道蛋白。蛋白免疫印迹结果显示,EHP00_492 蛋白在 EHP 成熟孢子中有表达,分子量为 21 kD。亚细胞定位分析结果显示,EHP00_492 蛋白定位于 EHP 成熟孢子的孢壁上。【结论】初步明确了 EHP00_492 蛋白的序列特征、结构特征及其与其他微孢子虫水通道蛋白的亲缘关系,以及其在 EHP 成熟孢子中的表达定位特征,可为进一步研究 EHP 水通道蛋白的功能提供基础。