反义抑制ghrelin对VEGF及其受体Fit-1 mRNA表达的影响

［目的］ 探讨ghrelin对蒙古绵羊脐静脉内皮细胞的血管内皮生长因子VEGF及其受体Flt-1 mRNA表达的影响。［方法］ 试验分为4组：Ⅰ组,空白对照组;Ⅱ组,脂质体组;Ⅲ组（SCON）,20 μmol/L正义寡核苷酸组;Ⅳ组（ASCON）,20 μmol/L反义寡核苷酸组。上述各组均在培养24、36、48 h后,采用实时荧光定量方法检测VEGF及其受体Flt-1 mRNA表达情况的变化。［结果］VEGF mRNA在Ⅰ、Ⅱ组表达量无差异,具有较高的表达量,随着时间的延长无明显变化;在Ⅲ组VEGF mRNA 表达略有降低,但与Ⅰ和Ⅱ组间无显著性差异（P＞0.05）;Ⅳ组（反义寡核苷酸组）的VEGF mRNA表达量显著下降（P＜0.05）,并且随着时间延长逐渐下降。VEGF受体FLT-1 mRNA的表达与VEGF相似。［结论］反义抑制ghrelin对VEGF及其受体Flt-1的mRNA表达有下调作用。     

反义抑制ghrelin对VEGF及其受体Flt-1 mRNA表达的影响

[目的] 探讨ghrelin对蒙古绵羊脐静脉内皮细胞的血管内皮生长因子VEGF及其受体Flt-1 mRNA表达的影响.[方法] 试验分为4组: I组,空白对照组;II组,脂质体组(不加寡核苷酸);III组(SCON),20 μmol/L正义寡核苷酸组;IV组(ASCON),20 μmol/L反义寡核苷酸组.上述各组均在培养24、36、48 h后,采用实时荧光定量方法检测VEGF及其受体Flt-1 mRNA表达情况的变化.[结果] VEGF和Flt-1熔解曲线表明扩增效果好,培养24 h, VEGF mRNA I组相对表达量为0.076 9,II组为0.076 8,III组为0.076 9,3组之间无显著性差异(P＞0.05),IV组VEGF mRNA 相对表达量下降为0.024 2,且与I、II、III组有显著性差异(P＜0.05).培养36 h,前3组相对表达量分别为0.059,0.051,0.051 4,3组之间无显著性差异(P＞0.05),第IV组为0.024 2,与前3组比较有显著性差异(P＜0.05).培养48 h,前3组相对表达量分别为0.061,0.055 2,0.052 1,3组之间无显著性差异(P＜0.05),第IV组为0.011 5,与前3组比较有显著性差异(P＜0.05).培养24 h,Flt-1 mRNA I组相对表达量为0.078 6;II组为0.078 2,III组为0.078 1, 3组之间无显著性差异(P＞0.05),IV组Flt-1 mRNA 相对表达量下降为0.025 6,且与I、II、III组有显著性差异(P＜0.05).培养36 h,前3组相对表达量分别为0.078 1,0.078 4,0.078 2,3组之间无显著性差异(P＞0.05),第IV组为0.022 8,与前3组比较有显著性差异(P＜0.05).培养48 h,前3组相对表达量分别为0.069 1,0.078 0,0.069 3,3组之间无显著性差异(P＞0.05),第IV组为0.021 5,与前3组比较有显著性差异(P＜0.05).可见,VEGF受体Flt-1mRNA的表达与VEGF相似.二者均在 I组、II组表达量无差异,具有较高的表达量,随着时间的延长没有明显变化;在III组表达轻微下降,但与I组和II组无显著性差异(P＞0.05);IV组的表达量显著下降(P＜0.05),并且随着时间的延长至逐渐下降.[结论] 反义抑制ghrelin对VEGF及其受体Flt-1的mRNA表达有下调作用.     

反义抑制ghrelin对VEGF及其受体Flt-1 mRNA表达的影响

[目的]探讨ghrelin对蒙古绵羊脐静脉内皮细胞的血管内皮生长因子VEGF及其受体Flt-1mRNA表达的影响。[方法]试验分为4组:I组,空白对照组;II组,脂质体组;III组(SCON),20μmol/L正义寡核苷酸组;IV组(ASCON),20μmol/L反义寡核苷酸组。上述各组均在培养24、36、48h后,采用实时荧光定量方法检测VEGF及其受体Flt-1mRNA表达情况的变化。[结果]VEGFmRNA在I、II组表达量无差异,具有较高的表达量,随着时间的延长无明显变化;在III组VEGFmRNA表达略有降低,但与I和II组间无显著性差异(P>0.05);IV组(反义寡核苷酸组)的VEGFmRNA表达量显著下降(P<0.05),并且随着时间延长逐渐下降。VEGF受体FLT-1mR-NA的表达与VEGF相似。[结论]反义抑制ghrelin对VEGF及其受体Flt-1的mRNA表达有下调作用。     

RNAi对绵羊颗粒细胞体外培养过程VEGF 及其受体mRNA表达的影响

[目的]明确RNA干扰(RNAi)对绵羊颗粒细胞体外培养过程中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体mRNA表达的影响,为开展VEGF在绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中信号通路的相关研究打下基础.[方法]采用电穿孔技术将针对VEGF两个受体Flt-1和KDR/Flk-1的两条有效双链小RNA导入绵羊颗粒细胞内,利用实时荧光定量PCR检测体外培养绵羊颗粒细胞各培养时间VEGF、Flt-1和KDR/Flk-1 mRNA表达水平的变化.设定筛选出的Flt-1和KDR/Flk-1有效干扰片段分别为试验组Ⅰ和试验组Ⅱ,两个干扰片段共同作用为试验组Ⅲ,无效的干扰片段为对照组.[结果]绵羊颗粒细胞体外培养过程中,VEGF mRNA在各时间段的相对表达量是Flt-1 mRNA相对表达量的102倍、KDR/Flk-1 mRNA相对表达量的103倍;培养第1 d时,试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组ⅢVEGF mRNA相对表达量分别为2.62×10-2、3.54×10-2和2.94×10-2,均极显著高于对照组(P<0.01,下同),3个试验组的VEGF mRNA表达量从第2 d开始降低,直到第6 d与对照组趋于一致.试验组ⅡFlt-1 mRNA相对表达量从培养第1 d的1.02×10-1逐渐降至第7 d的8.99×10-4,且一直极显著高于其他组;试验组Ⅰ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无Flt-1 mRNA表达,随着培养时间的延长逐渐呈上升趋势,第8 d时各组趋于一致.试验组Ⅰ的KDR/Flk-1 mRNA相对表达量从第1 d开始极显著低于对照组;试验组Ⅱ和试验组Ⅲ在前3 d几乎无KDR/Flk-1 mRNA相对表达,随着培养时间的延长呈上升趋势,第9 d时各组趋于一致.[结论]两个有效干扰片段在绵羊颗粒细胞体外培养过程中起到很好的干扰作用,可改变VEGF、Flt-1及KDR mRNA的表达量,进而影响颗粒细胞相关生长信号的传输.     

IL-6受体mRNA反义寡核苷酸抑制骨吸收的体外研究

目的：探讨IL-6RmRNA特异反义寡核苷酸(ASON)在体外对骨吸收的影响及意义。方法：采用器官培养法培养新生的小鼠颅盖骨，并分别用ASON、无义寡核苷酸(NSO)、IL-6或ASON与IL-6联合处理颅盖骨，未加药组为对照。培养一定时间后，测定培养上清液的钙含量，将实验组钙含量与对照组钙含量比值作骨吸收指数。结果：作用48h后，不同剂量的ASON均可轻度降低骨吸收指数，但无剂量依赖关系，ASON(5／μmol／L)对正常培养的颅盖骨的骨吸收的抑制率为8．6％；用IL-6培养颅盖骨使骨吸收指数呈剂量依赖关系升高，ASON(5．0／μmol／L)可能明显抑制由IL-6(40μg／L)引起的高骨吸收指数，其抑制率为58．0％；NSO对骨吸收指数无影响。ASON(5．0／μmol／L)分别作用12、24、48h的骨吸收指数则随时间延长而降低。结论：ASON阻断IL-6R表达后明显抑制IL-6刺激所致的新生小鼠颅盖骨骨吸收，而对正常培养的颅盖骨骨吸收抑制作用较弱。     

不同繁殖季节牦牛睾丸组织VEGF及其受体分布比较

【目的】探索VEGF及其受体(VEGFR2)在繁殖期和繁殖间期成年牦牛睾丸组织中的分布特点并进行比较分析.【方法】应用免疫组织化学SP法检测VEGF及其受体(VEGFR2)分布特征并通过IPP图像分析软件进行定量统计.【结果】免疫组织化学显示,成年牦牛睾丸中,VEGF表达于各级生精细胞以及Sertoli细胞和Leydig细胞,强表达于长形精子,小血管内皮细胞见强阳性表达,肌样细胞未见表达;其受体VEGFR2表达于各级生精细胞及Sertoli细胞,且Leydig细胞内强表达,小血管弱表达;性成熟牦牛睾丸组织中VEGF和VEGFR2的表达繁殖期高于繁殖间期,但无显著统计学差异(P0.05).【结论】VEGF及其受体在性成熟牦牛睾丸组织中表达丰富,表明其参与精子发生及局部微环境的调节,不同繁殖期有一定的表达差异,提示其表达与牦牛发情活动密切相关.     

HIF-1反义核酸对金鱼HIF-1α及其靶基因VEGF表达水平的影响

金鱼是低氧耐受能力最强的淡水鱼类之一,低氧诱导因子-1(hypoxia induced factor,HIF-1)在动物低氧应答调节中发挥关键作用,目前尚没有关于鱼类HIF-1抑制剂的研究报道。试验分析了HIF-1反义寡聚核苷酸对金鱼肝脏组织HIF-1及其靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的基因表达差异。荧光定量PCR结果显示,低氧状态下,30,60 mg/kg剂量的反义核酸能有效抑制VEGF基因的表达,但对HIF-1αm RNA水平没有影响。制备金鱼HIF-1兔源多克隆抗体并进行Western Blot分析,结果显示,60 mg/kg剂量的反义核酸抑制低氧所诱导的HIF-1蛋白水平的上升,表明合成的反义核酸能够特异性地抑制金鱼HIF-1 m RNA的翻译。金鱼HIF-1抗体的合成及反义寡聚核苷酸的制备,可为进一步探索金鱼独特的低氧应答机制提供有效研究手段。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因的克隆及其反义表达载体的构建

为了构建草莓乙烯受体FaEtr2基因的反义表达载体,在已报道的FaEtr2基因序列的基础上,设计特异引物,克隆草莓乙烯受体FaEtr2基因部分特异序列,将该片段反向插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr2。通过双酶切鉴定后,导入农杆菌EHA105中,酶切和PCR鉴定表明质粒已导入到农杆菌中。本研究为后期该反义基因转化草莓品种以改良草莓果实耐贮运性打下基础。     

梅花鹿VEGF基因的克隆及其在鹿茸顶端组织的表达

为了得到VEGF成熟肽基因,利用Trizol试剂法提取鹿茸顶端组织总RNA,反转录形成c DNA。根据Gen Bank已发表的相关基因序列设计1对特异性引物,并克隆VEGF成熟肽基因,再利用免疫组化法检测VEGF基因在鹿茸顶端不同组织的表达水平。结果表明:成功获得梅花鹿VEGF成熟肽基因,该基因长495 bp,共编码164个氨基酸;经Blast同源性分析,结果显示与牛、羊、猪的核苷酸序列的同源性分别为98.79%、97.98%、96.36%;经DNAMAN软件比对,其氨基酸序列的同源性分别为98.78%、97.56%、96.95%。免疫组化法结果显示,VEGF在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达,其中在软骨层中表达水平较高。     

莫桑比克罗非鱼ghrelin 受体基因的特性及ghrelin受体和ghrelin mRNA组织表达

[目的]了解莫桑比克罗非鱼ghrelin/GHSR系统的生理功能。[方法]采用RT-PCR和RACE技术分离莫桑比克罗非鱼2个GH-SR全长cDNA序列,并用荧光定量PCR方法检测了莫桑比克罗非鱼ghrelin基因及其受体GHSR-1a mRNA水平的组织表达,以及饥饿对这2个基因表达的影响。[结果]获得了莫桑比克罗非鱼2个GHSR cDNA全序列（GHSR-1a、GHSR-1b）。GHSR-1a序列全长1 627bp,编码384个氨基酸,具有7个跨膜结构域结构;GHSR-1b序列全长1 858 bp,编码298个氨基酸,只具有前5个TM,在第6个TM的第4个氨基酸处开始缺失。正常生理条件下,2基因在所检测组织中均有表达,但存在明显的组织差异。ghrelin主要由胃中分泌,除性腺外,雌鱼所有被检测组织的表达量均高于雄鱼的表达量,以肌肉中ghrelin基因的表达差异最大,雌鱼是雄鱼的30.4倍。莫桑比克罗非鱼GHSR-1a基因在垂体、肝脏、心脏中表达量较高,且被检测组织中雄鱼的表达量均高于雌鱼的表达量,其中鳃组织的表达差异最大,雄鱼是雌鱼的36.3倍。饥饿28 d后莫桑比克罗非鱼胃中ghrelin基因表达增加,雄鱼ghrelin基因分泌量增加了3.7倍,雌鱼增加了2.6倍;雌雄个体垂体中GHSR-1a的分泌量均略有下降。[结论]ghrelin/GHSR-1a系统可能具有调节莫桑比克罗非鱼能量平衡的作用。     

鱼类生长激素释放肽及其受体的研究进展

生长激素释放肽(Ghrelin)是生长激素促分泌素受体(Growth hormone secretagogue receptor,GHSR)的一种内源性配体,主要在胃肠道内产生.目前不少鱼类的Ghrelin基因和氨基酸序列已经确定.鱼类Ghrelin能促进生长激素(GH)、促黄体释放激素(LH)的分泌,并参与摄食调节,表明Ghrelin是一种具有多种生理活性的多肽.综述了鱼类Ghrelin及其受体的结构和分布,并对其调控机理进行了简要介绍,最后论述了Ghrelin在鱼类中的生理功能,旨在为Ghrelin在鱼类营养生理学及内分泌生理学中的研究提供参考.     

血管内皮生长因子及其受体在胚胎卵黄囊 不同发育时期的表达

为研究胚胎不同时期VEGF、KDR和CD34在人卵黄囊中的表达情况,了解胚胎造血的发育过程和机理。采用免疫组织化学SP法卵黄囊冰冻切片进行染色,光镜观察。结果发现在第3￣4周的人卵黄囊低表达VEGF和KDR,不表达CD34。4￣6周组强表达VEGF、KDR和CD34。在血岛内阳性细胞大而圆,成簇或分散聚集,有些细胞沿血岛边缘形成血管样结构。6周以后,卵黄囊弱表达VEGF、KDR和CD34。上述结果提示卵黄囊可表达造血和血管生成相关因子,随胚胎发育呈阶段性表达。卵黄囊中出现造血干细胞和血管内皮细胞的分化。     

去势对公猪生殖轴上Ghrelin和功能性Ghrelin受体mRNA的影响

【目的】探讨手术去势(阉割)、免疫去势对公猪下丘脑-垂体-睾丸轴上Ghrelin mRNA和功能性Ghrelin受体1a mRNA表达的影响。【方法】将21头公猪随机均分为免疫去势组、未去势组和手术去势组,免疫去势组于9周龄初次接种免疫去势疫苗,17周龄加强免疫;手术去势组在仔猪出生7d内进行阉割去势;未去势组不作任何处理。25周龄时屠宰所有公猪,取下丘脑、垂体和睾丸组织,以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR法检测公猪下丘脑-垂体-睾丸轴Ghrelin及其受体mRNA基因的相对表达量。【结果】手术去势、免疫去势和未去势公猪下丘脑Ghrelin及其功能性受体mRNA基因相对表达量的差异不显著(P0.05),未去势公猪垂体Ghrelin mRNA的相对表达量显著低于手术阉割去势公猪(P0.05),免疫去势公猪睾丸中Ghrelin受体mRNA的相对表达量显著高于未去势公猪(P0.05)。【结论】公猪生殖轴存在Ghrelin mRNA和功能性Ghrelin受体mRNA,且手术阉割去势导致垂体中Ghrelin mRNA的相对表达量增加,免疫去势增加了睾丸Ghrelin受体mRNA的相对表达量,提示Ghrelin可能对生殖轴有调节功能。     

甜瓜蔗糖合成酶基因(CmSS1)反义表达载体的构建及遗传转化

以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-CmSS1和表达载体pBI121,再用T4 DNA连接酶将回收的目的片段反向与pBI121连接。结果证明,CmSS1反向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmSS1的重组质粒;利用农杆菌介导法将反义CmSS1基因转化甜瓜,经PCR检测,得到5株转基因植株。这为以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性调节机制及通过基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基础。     

Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达

【目的】探讨Ghrelin和GHS-R1a mRNA在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达及二者表达与FSH之间的关系。【方法】 利用实时定量RT-PCR技术检测体外成熟进程中牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA水平表达变化,观察不同浓度FSH对Ghrelin和GHS-R1a mRNA表达的作用以及FSH与FSH受体抑制剂的组合对Ghrelin和GHS-R1a基因表达的影响。【结果】 实时定量RT-PCR结果揭示牛卵母细胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA的相对表达量随着成熟过程的延长而呈现一定变化规律,即Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中从8 h开始显著下降并持续此低表达水平到24 h;不同浓度FSH 显著抑制卵母细胞Ghrelin及GHS-R1a mRNA的表达,而FSH 受体抑制剂明显减弱FSH的抑制作用而促进二者表达。【结论】Ghrelin和GHS-R1a mRNA在卵母细胞体外成熟过程中的表达可能随着培养液中FSH升高而降低。     

正常孕妇与妊高症患者胎盘中Ghrelin、GHS-R mRNA的表达研究

[目的]通过比较正常孕妇与妊高症患者胎盘中Ghrelin及其受体GHS-RmRNA水平的变化,探讨Ghrelin及其受体与妊高症的发病是否相关。[方法]采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了正常孕妇胎盘和妊高症患者胎盘中Ghrelin及其受体GHS-RmRNA水平相对表达量的变化。[结果]正常孕妇胎盘组织中mRNA水平与妊高症患者胎盘组织中mRNA水平无显著性差异,但Ghrelin受体GHS-R在两者之间的mRNA水平有显著性差异（P〈0．05）。[结论]Ghrelin及其受体在妊高症患者和正常孕妇胎盘中表达的相对变化表明,Ghrelin受体缺乏可能成为妊高症发病的因素之一。